RP-HPLC法同時測定五酯片中10種木脂素類成分的含量Δ

張 琳，竇志華，蔡衛華，王建新，陳 霞，王征宇（.南通市第三人民醫院藥劑科，江蘇南通 6006；.南通市第三人民醫院肝膽外科，江蘇南通 6006）

RP-HPLC法同時測定五酯片中10種木脂素類成分的含量Δ

張 琳1＊，竇志華1，蔡衛華2#，王建新2，陳 霞1，王征宇1（1.南通市第三人民醫院藥劑科，江蘇南通 226006；2.南通市第三人民醫院肝膽外科，江蘇南通 226006）

目的：建立同時測定五酯片中五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素10種木脂素類成分的含量。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Symmetry C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結果：五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素檢測進樣量線性范圍分別為2.25～67.5 ng（r＝0.999 6）、2.1～63 ng（r＝0.999 8）、28～840 ng（r＝0.999 9）、124.6～3 738 ng（r＝0.999 9）、22.7～681 ng（r＝0.999 9）、32.7～981 ng（r＝0.999 9）、47～1 410 ng（r＝0.999 9）、208～6 240 ng（r＝0.999 9）、5.36～160.8 ng（r＝0.999 9）、4.48～134.4 ng（r＝0.999 8）；定量限分別為14.17、13.32、9.33、11.37、14.62、19.88、14.66、12.50、16.40、13.55 ng，檢測限分別為4.62、4.60、3.08、3.76、4.81、6.74、4.93、4.16、5.86、5.03 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為96.36%～100.00%（RSD＝1.83%，n＝6）、95.00%～100.00%（RSD＝2.07%，n＝6）、95.00%～98.00%（RSD＝1.22%，n＝6）、95.37%～98.91%（RSD＝1.29%，n＝6）、95.62%～103.71%（RSD＝2.85%，n＝6）、97.33%～102.67%（RSD＝2.00%，n＝6）、95.00%～99.33%（RSD＝1.75%，n＝6）、97.24%～104.93%（RSD＝2.63%，n＝6）、95.00%～97.50%（RSD＝1.42%，n＝6）、96.00%～102.00%（RSD＝2.45%，n＝6）。結論：該方法結果準確、靈敏度高、重復性好，可用于五酯片中10種木脂素類成分含量的同時測定。

五酯片；木脂素；反相高效液相色譜法；含量測定

五酯片是由南五味子乙醇提取物制成的保肝中藥制劑，能降低血清丙氨酸轉氨酶，臨床上常用于藥物肝損傷、酒精性肝炎的治療[1-2]。近年來，臨床及實驗研究表明五酯制劑可作為輔助藥物，聯合他克莫司用于肝臟、腎臟等實體器官移植患者的治療[3-6]，不但提高了他克莫司的血藥濃度和生物利用度[7-9]，降低了他克莫司的臨床使用劑量，減輕了患者經濟負擔，還減輕了因長期使用他克莫司而導致的肝腎損傷[10]。五酯片收載于國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-10557（ZD-0557）-2002-2012Z，其有效成分為五味子總木脂素，該標準是以五味子酯甲為對照品，用紫外分光光度法測定其含量，但該方法操作煩瑣，且標準中僅測定了五味子酯甲這1種木脂素類成分；2015年版《中國藥典》（一部）“南五味子”項下也僅以五味子酯甲作為其質量控制指標[11]，因南五味子乙醇提取物中含有多種木脂素類成分，以上測定方法均不能客觀反映五酯片的質量情況。鑒于此，本課題組采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了同時測定五酯片中10種木脂素類成分的含量，以期為全面控制該制劑的質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元泵、自動進樣器、在線脫氣裝置、2998PDA檢測器、Empower3工作站（美國Waters公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；BT 25S型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

五酯片（廣西方略藥業集團有限公司，批號：1402011、1409003、1501016、1505014、1506008，規格：0.31 g/片）；五味子酯戊對照品（批號：151031006）、戈米辛J對照品（批號：151031011）、當歸酰戈米辛H對照品（批號：151031013）、五味子酯甲對照品（批號：151031003）、五味子酯乙對照品（批號：151031020）、五味子酚對照品（批號：151031004）、安五酯素對照品（批號：151031021）、五味子丙素對照品（批號：151031002）均購自上海將來生物科技有限公司；五味子甲素對照品（批號：110764-201111）、五味子乙素對照品（批號：1100765-200710）均購自中國食品藥品檢定研究院，以上對照品純度均≥98%；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，0→50%A；25～35 min，50%→55%A；35～55 min，55%→50%A；55～70 min，50%→65%A；70～80 min，65%→70%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：225 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五酯素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素對照品各適量，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成上述10種木脂素類成分的質量濃度分別為2.25、2.1、28、124.6、22.7、32.7、47、208、5.36、4.48 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，去除包衣，研細，取約0.55 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：53 kHz，下同）處理30 min，取出，放至室溫，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備不含上述10種木脂素類成分的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

例1[21]77 科學研究表明，宇宙射線在大氣中能夠產生放射性碳14.碳14的衰變極有規律，其精確性可以稱為自然界的“標準時鐘”，動植物在生長過程中衰變的碳14，可以通過與大氣的相互作用得到補充，所以活著的動植物每克組織中的碳14含量保持不變，機體中原有的碳14按確定的規律衰減，我們已經知道其“半衰期”為5730年.湖南長沙馬王堆漢墓女尸出土時碳14的殘余量約占原始量的76.7%，試推算馬王堆古墓的年代．(求解過程略)

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以五味子酯戊峰計＞5 000，保留時間為20.501 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜法Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20、30 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的LOQ分別為14.17、13.32、9.33、11.37、14.62、19.88、14.66、12.50、16.40、13.55 ng，LOD分別為4.62、4.60、3.08、3.76、4.81、6.74、4.93、4.16、5.86、5.03 ng。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.6 精密度試驗

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1501016）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五酯素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素峰面積的RSD分別為0.83%、1.78%、0.61%、0.88%、1.45%、2.31%、0.77%、0.84%、1.67%、0.77%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批號（批號：1501016）的樣品適量，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，五味子酯戊、戈米辛J、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、安五酯素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素峰面積的RSD分別為2.53%、0.71%、1.32%、0.61%、0.77%、0.91%、0.86%、0.62%、0.97%、0.65%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：1501016）適量，共6份，精密稱定，各置于具塞錐形瓶中，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

續表2Continued tab 2

2.10 樣品含量測定

取5批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

表3 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.1 檢測波長的選擇

本課題組采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm波長范圍內對待測成分對照品溶液進行了全波長掃描。結果顯示，10種木脂素類成分在210～250 nm波長間呈現最大紫外吸收，綜合考慮，最終選擇225 nm為本試驗的檢測波長。

3.2 流動相和洗脫方式的選擇

本試驗曾考察了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液（0.05%～0.2%）、乙腈-磷酸溶液（0.05%～0.2%）等為流動相進行等度和梯度洗脫時的色譜情況。結果，選用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，基線噪音小，待測成分色譜峰形尖銳，分離度均＞1.5，因此本試驗選擇上述流動相和洗脫方式。

3.3 提取方法和提取時間的考察

本課題組考察了不同的提取方法（超聲和回流法）以及提取時間（30、45、60 min）。結果，超聲提取30 min，待測成分的提取率最高，因此選擇上述方式進行樣品的提取。

綜上所述，本方法結果準確、靈敏度高、重復性好，可用于五酯片中10種木脂素類成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 10 Lignanoids in Wuzhi Tablets by RP-HPLC

ZAHNG Lin1，DOU Zhihua1，CAI Weihua2，WANG Jianxin2，CHEN Xia1，WANG Zhengyu1（1.Dept.of Pharmacy，Nantong Third People’s Hospital，Jiangsu Nantong 226006，China；2.Dept.of Hepatobiliary Surgery，Nantong Third People’s Hospital，Jiangsu Nantong 226006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for content determination of schizantherin E，gomisin J，angeloylgomisin H，schisantherin A，schisantherin B，schisanhenol，anwuligan，schizandrin A，schizandrin B and schizandrin C in Wuzhi tablets. METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Symmetry C18column with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set 225 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of schizantherin E，gomisin J，angeloylgomisin H，schisantherin A，schisantherin B，schisanhenol，anwuligan，schizandrin A，schizandrin B and schizandrin C were 2.25-67.5 ng（r＝0.999 6），2.1-63 ng（r＝0.999 8），28-840 ng（r＝0.999 9），124.6-3 738 ng（r＝0.999 9），22.7-681 ng（r＝0.999 9），32.7-981 ng（r＝0.999 9），47-1 410 ng（r＝0.999 9），208-6 240 ng（r＝0.999 9），5.36-160.8 ng（r＝0.999 9），4.48-134.4 ng（r＝0.999 8）.The limits of quantitation were 14.17，13.32，9.33，11.37，14.62，19.88，14.66，12.50，16.40，13.55 ng.The limits of detection were 4.62，4.60，3.08，3.76，4.81，6.74，4.93，4.16，5.86，5.03 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were less than 3.0%；the recoveries were 96.36%-100.00%（RSD＝1.83%，n＝6），95.00%-100.00%（RSD＝2.07%，n＝6），95.00%-98.00%（RSD＝1.22%，n＝6），95.37%-98.91%（RSD＝1.29%，n＝6），95.62%-103.71%（RSD＝2.85%，n＝6），97.33%-102.67%（RSD＝2.00%，n＝6），95.00%-99.33%（RSD＝1.75%，n＝6），97.24%-104.93%（RSD＝2.63%，n＝6），95.00%-97.50%（RSD＝1.42%，n＝6），96.00%-102.00%（RSD＝2.45%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The developed method is accurate，sensitive and reproducible，and it can be used for content determination of 10 lignanoids in Wuzhi tablets.

Wuzhi tablet；Lignanoids；RP-HPLC；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3422-04

2017-01-10

2017-03-28）

（編輯：劉 柳）

江蘇省藥學會Shire生物藥學基金立項課題（No. S201608）；南通市衛生計生委青年醫學人才科研立項課題（No. WQ2016017）；南通市科技計劃（指導性）項目（No.YYZ16017）；南通市科技計劃項目（No.MS22015086）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：中藥質量控制。E-mail：Juezhangyan@163.com

#通信作者：主任醫師。研究方向：肝膽外科。電話：0513-85116027。E-mail：377511542@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.32