HPLC法同時測定六味能消丸中8種成分的含量

康 慧，劉亞蓉（1.青海省人民醫院藥房，西寧 810008；2.青海省藥品檢驗檢測院，西寧 810016）

HPLC法同時測定六味能消丸中8種成分的含量

康 慧1＊，劉亞蓉2#（1.青海省人民醫院藥房，西寧 810008；2.青海省藥品檢驗檢測院，西寧 810016）

目的：建立同時測定六味能消丸中土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm（土木香內酯、異土木香內酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）、270 nm（沒食子酸），柱溫為25℃，進樣量為10 μL。結果：土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚檢測進樣量線性范圍分別為0.121～3.63 μg（r＝0.999 9）、0.122～3.66 μg（r＝0.999 9）、0.219～6.57 μg（r＝0.999 9）、0.016 4～0.492 μg（r＝0.999 7）、0.017 3～0.519 μg（r＝0.999 9）、0.015 3～0.459 μg（r＝0.999 9）、0.007 2～0.216 μg（r＝0.999 9）、0.016 2～0.486 μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.41、0.26、0.35、0.13、0.17、0.14、0.15、0.13 ng，檢測限分別為0.12、0.08、0.11、0.04、0.05、0.04、0.05、0.04 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.05%～102.46%（RSD＝1.75%，n＝6）、98.55%～102.89%（RSD＝1.91%，n＝6）、98.53%～102.34%（RSD＝1.66%，n＝6）、101.71%～103.41%（RSD＝0.57%，n＝6）、101.04%～103.01%（RSD＝0.69%，n＝6）、101.63%～102.75%（RSD＝0.39%，n＝6）、96.94%～101.11%（RSD＝1.61%，n＝6）、98.06%～99.10%（RSD＝0.40%，n＝6）。結論：該方法準確、簡便，可用于六味能消丸中8種成分含量的同時測定。

六味能消丸；土木香內酯；異土木香內酯；沒食子酸；大黃素；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素甲醚；大黃酚；高效液相色譜法；含量

藏藥是我國傳統醫藥的重要組成部分，尤其在治療心血管、消化系統等慢性病方面獨具優勢。藏成藥六味能消丸由藏木香、干姜、訶子、大黃、寒水石、堿花6味中藥組成，具有助消化、消腫、理風和胃的功效[1]。六味能消丸現行標準收載于《衛生部頒藏藥標準》（第一冊）[2]，藏文名稱西切周巴日布；現行標準中僅有1個理化鑒別反應，無含量測定項，無法全面控制該制劑的質量。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定六味能消丸中藏木香主要成分（土木香內酯、異土木香內酯）[3]、訶子主要成分（沒食子酸）[4-5]、大黃主要成分（大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）[6]含量的方法[7]，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2998型光電二極管陣列檢測器、四元泵、自動進樣器、Empower工作站（美國Waters公司）；XS105DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CPA225D型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；B2500S-MT型超聲波清洗器（上海必能信超聲清洗有限公司）；Milli-QAdvantageA10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

六味能消丸（青海省格拉丹東藥業有限公司，批號：20140401、20140702、20150106，規格：0.3 g/丸；西藏藏醫學院藏藥有限公司，批號：20141211、20150306，規格：0.6 g/丸）；土木香內酯對照品（批號：110760-200507）、異土木香內酯對照品（批號：110761-200203）、沒食子酸對照品（批號：110831-201204）、大黃素對照品（批號：110756-200110）、蘆薈大黃素對照品（批號：110795-9803）、大黃酸對照品（批號：110757-200206）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-201013）、大黃酚對照品（批號：110796-201017%）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%冰醋酸溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm（土木香內酯、異土木香內酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）、270 nm（沒食子酸）；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含上述成分0.231、0.256、1.190、0.173、0.153、0.164、0.162、0.072 mg的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述單一對照品貯備液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成每1 mL分別含上述成分0.023 1、0.025 6、0.119 0、0.017 3、0.015 3、0.016 4、0.016 2、0.007 2 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過40目篩）約0.5 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率：110 W，頻率：42 kHz，下同）處理30 min，放至室溫，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺藏木香、訶子、大黃的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數均＞4 000。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、15、20、25、30μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量為橫坐標（x，μg）、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結果見表3。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 LOQ與LOD測定結果（ng）Tab 3 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚峰面積的RSD分別為0.87%、1.12%、0.96%、0.97%、1.27%、1.33%、1.82%、1.64%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20140401）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚峰面積的RSD分別為1.22%、1.29%、1.71%、1.47%、1.62%、1.55%、1.39%、1.66%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品粉末（批號：20140401）約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，土木香內酯、異土木香內酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚的含量平均值分別為1.02、1.11、4.76、0.33、0.34、0.65、0.15、0.52 mg/g，RSD分別為1.27%、1.36%、1.51%、1.44%、1.72%、1.98%、1.02%、0.96%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20140401）適量，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定結果

取5批樣品粉末各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗曾考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液和乙腈-0.1%冰醋酸溶液等二相流動相在系統不同梯度條件下進行洗脫時的色譜分離情況[8-11]，結果均未獲得滿意的分離效果；后采用甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液三相流動相系統在文中所示梯度洗脫程序下進行洗脫，色譜分離均較好，因此選擇上述流動相為本試驗的最終流動相。

3.2 檢測波長的選擇

本試驗采用光電二級檢測器在190～400 nm波長范圍內對“2.2.1”項下的單一對照品貯備液進行了全波長掃描，由紫外掃描結果可知，土木香內酯、異土木香內酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚在254 nm波長處有最大吸收，沒食子酸在270 nm波長處有最大吸收，因此選擇本試驗的測定波長為254 nm和270 nm。

3.3 提取溶劑和提取方式的選擇

本試驗曾考察了不同的提取溶劑（50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇、95%乙醇溶液）[12-13]，不同的提取方式（超聲處理20、30、40 min，回流30 min、冷浸4 h后提取）。結果，甲醇超聲處理30 min的提取率最高，且操作簡單，因此選擇上述提取溶劑和提取方式處理樣品。

綜上所述，本方法準確、簡便，可用于六味能消丸中8種成分含量的同時測定。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 8 Components in Liuwei Nengxiao Pills by HPLC

KANG Hui1，LIU Yarong2（1.Dept.of Pharmacy，Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining 810008，China；2. Qinghai Institute for Drug Control，Xining 810016，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of alantolactone，isoalantolactone，gallic acid，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion and chrysophanol in Liuwei nengxiao pills.METHODS：HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.1%glacial acetic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 254 nm（alantolactone，isoalantolactone，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion and chrysophanol），270 nm（gallic acid）.The column temperature was 25℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of alantolactone，isoalantolactone，gallic acid，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion，chrysosphanol were 0.121-3.63 μg（r＝0.999 9），0.122-3.66 μg（r＝0.999 9），0.219-6.57 μg（r＝0.999 9），0.016 4-0.492 μg（r＝0.999 7），0.017 3-0.519 μg（r＝0.999 9），0.015 3-0.459 μg（r＝0.999 9），0.007 2-0.216 μg（r＝0.999 9），0.016 2-0.486（r＝0.999 9）.The limits of quantification were 0.41，0.26，0.35，0.13，0.17，0.14，0.15，0.13 ng；limits of detection were 0.12，0.08，0.11，0.04，0.05，0.04，0.05，0.04 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.05%-102.46%（RSD＝1.75%，n＝6），98.55%-102.89%（RSD＝1.91%，n＝6），98.53%-102.34%（RSD＝1.66%，n＝6），101.71%-103.41%（RSD＝0.57%，n＝6），101.04%-103.01%（RSD＝0.69%，n＝6），101.63%-102.75%（RSD＝0.39%，n＝6），96.94%-101.11%（RSD＝1.61%，n＝6），98.06%-99.10%（RSD＝0.40%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is accurate，simple and suitable for simultaneous determination of 8 components in Liuwei nengxiao pills.

Liuwei nengxiao pill；Alantolactone；Isoalantolactone；Gallic acid；Emodin；Aloe-emodine；Rhein；Physcion；Chrysophanol；HPLC；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3433-04

2017-03-15

2017-05-03）

＊主管藥師。研究方向：中藏藥質量控制。電話：0971-8066232。E-mail：736211102@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：中藏藥檢驗及質量標準。電話：0971-8232182

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.35