蔗糖鐵注射液過濾除菌前配制液的微生物限度檢查方法研究

張永昕，曾佳艷，李莎恩，俞 發，王振華，李 耿（.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 50006；.解放軍第458醫院，廣州 5060；.廣東天普生化醫藥股份有限公司，廣州 5050）

蔗糖鐵注射液過濾除菌前配制液的微生物限度檢查方法研究

張永昕1，2＊，曾佳艷3，李莎恩2，俞 發2，王振華1#，李 耿1（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006；2.解放軍第458醫院，廣州 510602；3.廣東天普生化醫藥股份有限公司，廣州 510520）

目的：建立蔗糖鐵注射液過濾除菌前配制液的微生物限度檢查方法。方法：按照2015版《中國藥典》（四部）“通則1005”和“通則1006”微生物限度檢查方法，分別采用平皿法和薄膜過濾法檢查需氧菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）數、霉菌及酵母菌（白色念珠菌、黑曲霉）數，通過比較試驗菌回收率來確定適宜的方法，并進行方法驗證。結果：以平皿法進行試驗，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率分別為2%、5%，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋樣品原液10倍后，試驗菌回收率范圍為88%～96%，但培養基顏色較深。以薄膜過濾法不加沖洗液進行試驗，試驗菌回收率范圍為88%～95%；加入沖洗液后，試驗菌回收率范圍為91%～103%。經驗證，加入沖洗液的薄膜過濾法回收率為50%～200%，符合規定。結論：本試驗建立的薄膜過濾法較平皿法試驗菌回收率高且加入沖洗液后，試驗菌回收率更高，濾膜表面均無顏色較深的物質殘留影響計數，適用于蔗糖鐵注射液過濾除菌前配制液的微生物限度檢查。

蔗糖鐵注射液；配制液；微生物限度檢查；薄膜過濾法；平皿法

蔗糖鐵注射液是目前應用較為廣泛的靜脈鐵劑之一，該制劑在臨床上常用于口服鐵劑效果不好而需要靜脈鐵劑治療的患者，其改善患者貧血和缺鐵癥狀的療效優于口服多糖鐵復合物，并能準確估算補鐵劑量，不良反應發生率低于口服鐵劑[1-3]。蔗糖鐵注射液質量標準收載于《國家食品藥品監督管理局標準》（標準文號YBH07292006），但現行國內外標準中均未收載蔗糖鐵注射液過濾除菌前配制液（以下簡稱“蔗糖鐵注射液稀配液”）的微生物限度檢查方法，且未見相關文獻報道。

根據2011年版《藥品生產質量管理規范》（GMP）的要求[4]，應當依據所有滅菌方法的滅菌效果確定產品滅菌前微生物污染水平的監控標準，并定期監控。企業在日常生產過程中應當做好微生物污染水平的監控工作，對產品的含菌量進行分析，及時發現不良趨勢，并采取相應的措施確保產品的無菌保證水平[5-6]。因此，為了確保蔗糖鐵注射液的無菌保證水平，需準確了解蔗糖鐵注射液稀配液的微生物污染水平，以確保其微生物檢查的有效性，故筆者參考2015年版《中國藥典》（四部）“通則1005”和“通則1006”微生物限度檢查法[6]，建立了蔗糖鐵注射液稀配液的微生物限度檢查方法，并進行了方法學驗證。

1 材料

1.1 儀器

ZW-600型集菌儀（溫州維科生物實驗設備有限公司）；ZW-3B型開放式過濾集菌培養器（溫州維科生物實驗設備有限公司）；CL-32L型高壓滅菌器（日本ALP公司）；JC303-4A型電加熱隔水式培養箱（上海嘉程儀器設備廠）；AC2-5S1型生物安全柜（新加坡ESCO公司）。

1.2 藥品與試劑

蔗糖鐵注射液稀配液[由廣東天普生化醫藥股份有限公司自制，批號：36150903、36150904、36150905，規格：5 mL∶100 mg（鐵）]；聚山梨酯80（成都市科龍化學試劑廠，批號：2014092201）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（美國Merck公司，批號：VM680982514）。

1.3 試驗用菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均購自中國食品藥品檢定研究院。金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為第3代，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌為第4代，黑曲霉為第2代。

1.4 培養基

胰酪大豆胨液體培養基（批號：VM631759410）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：VM565439333）均購自美國Merck公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：3103191）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：3104660）均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

分別取經32.5℃在胰酪大豆胨液體培養基培養24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養物各1 mL，分別用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至每0.1 mL含≤100 cfu/mL的單一菌懸液（最終金黃色葡萄球菌共稀釋106倍、銅綠假單胞菌共稀釋106倍、枯草芽孢桿菌共稀釋105倍），作菌落計數備用。取經22.5℃在沙氏葡萄糖液體培養基培養2 d的白色念珠菌培養物1 mL，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至每0.1 mL含≤100 cfu/mL的菌懸液（共稀釋104倍），作菌落計數備用。取經22.5℃在沙氏葡萄糖瓊脂培養基培養7 d的黑曲霉培養物，加4 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌吸管吸出孢子懸液1 mL，置于無菌試管內，再用含0.05%聚山梨酯80的 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至每0.1 mL含≤100 cfu/mL的孢子懸液（共稀釋103倍），作菌落計數備用[7]。

2.2 方法與結果

2.2.1 平皿法 （1）供試液。取樣品稀配液（批號：36150903）適量作為供試液。（2）供試品對照組。取供試液1 mL，平行注入2個無菌平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，待凝固后，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數，測定供試品本底需氧菌數。取供試液1 mL，平行注入2個無菌平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，待凝固后，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數，測定供試品本底霉菌及酵母菌數。（3）試驗組。取供試液1 mL和“2.1”項下的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的單一菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，分別注入平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數。取供試液1 mL和“2.1”項下的白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，分別注入平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數。（4）菌液對照組。取“2.1”項下的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的單一菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，分別注入平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數，測定所加試驗菌數。取“2.1”項下白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液0.1 mL，分別注入平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數，測定所加試驗菌數。（5）回收率計算。試驗菌回收率（%）＝（試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數×100%。（6）結果分析。平皿法試驗菌回收率結果見表1。由表1可知，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均＜50%，不符合2015年版《中國藥典》規定，不可采用此法直接進行微生物限度檢查[8]。

表1 平皿法試驗菌回收率結果（CFU）Tab 1 Results of bacterial recoveries by plate method（CFU）

2.2.2 平皿法（即稀釋法） 即對供試液進行稀釋。取“2.2.1”項下供試液10 mL（批號：36150903），加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL對其進行稀釋，即得稀釋供試液。試驗組、菌液對照組、供試品對照組均按“2.2.1”項下相應步驟操作，結果見表2。由表2可知，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均＞50%，但是在試驗中發現，加入稀釋供試液的培養基顏色較深，對點計菌落數造成干擾。為了保證樣品稀配液的檢驗量，故不采用平皿法進行樣品稀配液的微生物限度檢查。

表2 稀釋法試驗菌回收率結果（CFU）Tab 2 Results of bacterial recoveries by dilution method（CFU）

2.2.3 薄膜過濾法（a）（1）試驗組。取“2.2.1”項下供試液（批號：36150903）10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，分別加入“2.1”項下的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的單一菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，濾過，取出濾膜，菌面朝上分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，每種試驗菌平行做2次，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數。取供試液10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，分別加入“2.1”項下的白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，濾過，取出濾膜，菌面朝上分別貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，每種試驗菌平行做2次，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數。（2）菌液對照組。同“2.2.1”項下相應步驟操作。（3）供試品對照組。取上述供試液10 mL，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數，測定供試品本底需氧菌數。取上述供試液10 mL，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數，測定供試品本底霉菌及酵母菌數，結果見表3。由表3可知，試驗菌回收率均在50%～200%內，符合2015年版《中國藥典》的相關規定[8]。

2.2.4 薄膜過濾法（b）（1）試驗組。取“2.2.1”項下供試液（批號：36150903）10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過，加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，在沖洗液中分別加入“2.1”項下的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的單一菌懸液和黑曲霉孢子懸液各0.1 mL，濾過，取出濾膜，菌面朝上分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，每種試驗菌平行做2次，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數。取上述供試液10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過，加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，在沖洗液中分別加入“2.1”項下的白色念珠菌菌懸液和黑曲霉的孢子懸液各0.1 mL，濾過，取出濾膜，菌面朝上分別貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，每種試驗菌平行做2次，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數。（2）菌液對照組。同“2.2.1”項下相應步驟操作。（3）供試品對照組。取上述供試液10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過，加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，在32.5℃培養箱中培養3 d，計數，測定供試品本底需氧菌數。取供試液10 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，濾過加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，在22.5℃培養箱中培養5 d，計數，測定供試品本底霉菌及酵母菌數，結果見表4。由表4可知，試驗菌回收率均在50%～200%內，符合2015年版《中國藥典》規定[7]，且b方法試驗菌回收率均高于a方法，因此采用b方法進行方法驗證。

表3 薄膜過濾法（a）試驗菌回收率結果（CFU）Tab 3 Results of bacterial recoveries by membrane filtration method（a）（CFU）

表4 薄膜過濾法（b）試驗菌回收率結果（CFU）Tab 4 Results of bacterial recoveries by membrane filtration method（b）（CFU）

2.3 方法驗證

取3批樣品（批號：36150903、36150904、36150905）各適量，采用薄膜過濾法中（b）進行方法驗證，結果見表5。由表5可知，試驗菌回收率均在50%～200%內，符合2015年版《中國藥典》規定[7]，且重復性好，可以采用薄膜過濾法中（b）進行微生物限度檢查。

表5 薄膜過濾法（b）驗證的回收率結果（CFU）Tab 5 Results of bacterial recoveries by membrane filtration method（b）validation（CFU）

3 討論

3.1 蔗糖鐵注射液稀配液中抑菌活性的消除

水溶性樣品可用原液進行微生物限度檢查，蔗糖鐵注射液稀配液易溶于水，且用其原液檢查簡單方便，故筆者首先用其原液進行平皿法計數驗證。結果，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的試驗菌回收率均＜50%，說明該產品具有抑菌活性，這可能與其堿性較強有關（測得其pH為11.0），于是對樣品原液稀釋10倍，稀釋后pH為7.32，則可以消除其抑菌活性[9-11]。

3.2 微生物限度檢查方法的選擇

蔗糖鐵注射液稀配液稀釋10倍后，由于pH的降低及其他可能的抑菌物質減少，采用稀釋法，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的試驗菌回收率均符合要求，但因為供試液的顏色為棕黑色，加入供試液的培養基顏色較深，點計菌落數時對分辨菌落造成干擾，影響結果的準確性，故不采用該法。采用薄膜過濾法，試驗菌回收率均能達到要求，且銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的試驗回收率明顯高于平皿法，說明薄膜過濾法能對抑菌物質進一步消除。其中，用100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗的薄膜過濾法，試驗菌回收率最高，且濾膜幾乎無棕黑色的物質殘留，不影響計數。因此，確定蔗糖鐵注射液稀配液的微生物限度檢查方法為本文薄膜過濾法（b）[12-13]。

綜上所述，本試驗建立的薄膜過濾方法較平皿法試驗菌回收率高，濾膜表面無顏色較深的物質殘留影響計數，適用于蔗糖鐵注射液稀配液的微生物限度檢查。

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（編輯：劉 柳）

Study on the Method of Microbial Limit Test for Preparation Liquid of Iron Sucrose Injection before Filtration and Sterilization

ZHANG Yongxin1，2，ZENG Jiayan3，LI Sha’en2，YU Fa2，WANG Zhenhua1，LI Geng1（1.School of TCM，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.No.458 Hospital of PLA，Guangzhou 510602，China；3. Guangdong Techpool Biopharma Co.，Ltd.，Guangzhou 510520，China）

OBJECTIVE：To establish a method of microbial limit test for liquid preparation of Iron sucrose injection before filtration and sterilization.METHODS：According to the microbial limit test in the“1005”and“general rules 1006”of 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia（vol.Ⅴ），plate method and membrane filtration method were used to measure total number of aerobic bacteria（Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Bacillus subtilis，Candida albicans，Aspergillus niger）and total number of molds and yeasts（C.albicans，A.niger）.The optimal test method was obtained by comparing the bacterial recoveries.RESULTS：By plate method，the recoveries of P.aeruginosa and B.subtilis were 2%and 5%.The test sample was diluted 10 times with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer solution，and the bacterial recoveries were in the range of 88%to 96%；but he medium was dark in color.By membrane filtration method，without rinse solution，the bacterial recoveries in the range of 88%to 95%. Add rinse solution，the bacterial recoveries were in the range of 91%to 103%.After validated，the recoveries of menbrane filtration method with tlushing tluid ranged 50%-200%，which was in line with the requnements.CONCLUSIONS：The membrane filtration method established in this experiment has higher bacterial recovery rate than the plate method.The bacterial recoveries rate were higher after adding rinse solution，and no dark substance in the surface of filter membrane affect the account.It can be used as the microbial limit test method for preparation liquid of Iron sucrose injection before filtration and sterilization.

Iron sucrose injection；Preparation liquid；Microbial limit test；Membrane filtration method；Plate method

R927.1

A

1001-0408（2017）24-3437-04

2016-12-22

2017-06-07）

＊主管藥師，碩士研究生。研究方向：醫院藥學、中藥新技術。電話：020-61639857。E-mail：20691072@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：藥物制劑。電話：020-39358550。E-mail：wzh@gzucm.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.36