骨質疏松性骨折的小鼠模型探索

李偉龍 余霄 毛賓堯 龐清江

骨質疏松性骨折的小鼠模型探索

李偉龍 余霄 毛賓堯 龐清江

目的 建立操作簡單、重復性好的骨質疏松性骨折小鼠動物模型，以用于中老年女性絕經后骨質疏松性骨折愈合情況的研究。方法 選取12周齡健康的C57BL/6J雌性小鼠50只，其中基線組10只，去勢組20只，假手術組20只。常規飼養1周后，處死基線組小鼠并測量血清雌激素水平，去勢組小鼠通過腹正中切口行雙側卵巢切除，假手術組小鼠切除雙側卵巢周圍等量的脂肪組織。去勢后4周對小鼠的左大腿行后外側切口，暴露股骨，從膝關節處逆行插入鋼針進行髓內固定，直視下用手術刀切斷股骨中下1/3段部分，造成股骨的橫行或斜行骨折。兩組小鼠在骨折術后2周和4周分別處死10只，測量血清雌激素水平、骨痂處骨密度（BMD）及Micro-CT情況。 結果 術后2周和4周假手術組雌激素濃度均高于去勢組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。術后2周和4周假手術組和去勢組BMD、骨體積、骨體積分數比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。雖然術后2周假手術組和去勢組骨小梁分離度（Tb.Sp）比較差異無統計學意義（P＞0.05），但術后4周兩組Tb.Sp比較差異有統計學意義（P＜0.05），而術后2周和4周兩組骨小梁結構模型指數比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 結論 小鼠骨質疏松性骨折模型具有操作簡單、直觀穩定等優點；去勢后的小鼠成骨能力明顯下降，可用于原發性絕經后骨質疏松性骨折的愈合及其骨代謝的細胞、分子及信號通路的機制研究。

雌性小鼠 去勢 骨質疏松性骨折 動物模型

原發性骨質疏松以絕經后婦女最多見，常導致骨量嚴重丟失，而其引起的骨質疏松性骨折嚴重影響中老年人的生活質量，增加了家庭和社會的經濟負擔。絕經后骨質疏松以雌激素水平明顯下降為特點，影響骨的吸收及轉化，并增加骨折的風險[1]。近年來，許多學科開展了雌性小鼠去除雙側卵巢建立骨質疏松動物模型的研究，并不斷探索在骨質疏松模型基礎上制作簡單有效的骨折模型[2]。有學者設計了一種閉合性小鼠股骨骨折模型[3-4]，但是該種造模方法需要專門的骨折造模架，實驗操作比較復雜。又有學者提出在直視下造成雄性小鼠股骨骨折模型后再行髓內固定[5]，但是該內固定方式能否在一定的觀察時間段內維持有效的固定強度還有待考證。本研究將雌性小鼠去除卵巢后制作股骨骨質疏松性骨折模型，觀察并評價造模效果，并行髓內固定，以模擬中老年女性絕經后骨質疏松性骨折的愈合情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 選取12周齡健康C57BL/6J雌性小鼠50只，平均重量19～20g，購自廣州動物實驗中心。合籠飼養1周，13周齡時隨機挑選10只作為基線組對照，其余40只隨機分為去勢組20只和假手術組20只。

1.2 動物模型的建立

1.2.1 骨質疏松模型的建立 去勢組小鼠異氟烷氣體(300ml/min)吸入麻醉后，常規備皮，皮膚消毒，于腹部正中線剪開約為1.5cm，暴露雙側輸卵管及卵巢，并將輸卵管的卵巢側結扎，去除卵巢及結扎的輸卵管，術畢縫合傷口，并于術后連續3d腹腔注射青霉素。假手術組小鼠僅切除雙側卵巢周圍等量的脂肪組織，術畢縫合傷口，并于術后連續3d腹腔注射青霉素。術后將切除的卵巢組織進行包埋和切片并行HE染色。異氟烷、青霉素及染色所用試劑均由南方醫科大學脊柱脊髓損傷實驗室提供。

1.2.2 股骨骨折模型的建立 將去勢組和假手術組小鼠常規飼養4周后，相同方法麻醉，左側大腿備皮，皮膚消毒，參考相關文獻[3-5]，于左大腿后外側作切口，鈍性分離肌肉及軟組織，暴露股骨，從膝關節處逆行插入直徑為0.45mm的鋼針進行髓內固定，直視下用手術刀切斷股骨中下1/3處，造成橫行或斜行骨折（橫行或短斜行骨折35只，長斜行骨折5只）。術畢縫合切口。術后連續3d腹腔注射青霉素，定時觀察傷口愈合情況，所有小鼠均未發生感染，切口愈合良好。

1.3 血清指標檢測 將基線組小鼠在13周齡時處死取血，去勢組和假手術組小鼠建模后2周和4周分別處死10只取血（均用眼球取血法）。采用ELISA法檢測小鼠血清中雌激素水平，試劑盒購自廣州維博鑫生物科技有限公司（950035048，96T/48T）。

1.4 骨痂處骨密度（bonemineral density，BMD）檢測和Micro-CT檢查 將建模后2周和4周處死的小鼠左側股骨分離，小心剝離周圍的軟組織及肌肉，并拔除鋼針，將整段股骨浸泡在10%甲醛溶液中48h后取出放在70%乙醇中4℃保存，取左側股骨進行Micro-CT（skyscan1176，Bruker，美國）檢查。股骨用濕潤的紙巾包裹，放入樣本掃描固定器中，確保股骨長軸和掃描器長軸一致。掃描參數設定：選定全部骨痂區域，50kV，98μA，每層厚度9μm，掃描結束后運用Micro-CT自帶軟件進行BMD、術后X線片、CT等數據分析。其中BMD是最直觀反映骨質疏松程度的指標，也是臨床最常用的指標。骨體積（BV）代表骨小梁本身的體積，骨體積分數（BV/TV）代表骨小梁體積占骨組織體積的百分比，這兩個值越大，代表骨量越多，是反映骨量多少的重要指標。骨小梁分離度（Tb.Sp）是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，Tb.Sp的增加，提示骨吸收增加，可能發生骨質疏松。結構模型指數（SMI）是定義骨小梁板狀和桿狀的程度，SMI數值越高，代表骨小梁從板狀向桿狀轉變，表明發生了骨質疏松。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠雌激素水平比較 術后2周，假手術組雌激素水平為（41.59±2.51）pg/ml，高于去勢組的（37.12± 2.40）pg/ml，差異有統計學意義（P＜0.05）。術后4周，假手術組雌激素水平為（40.28±1.90）pg/ml，高于去勢組的（29.74±3.07）pg/ml，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組小鼠術后2周和4周雌激素水平比較（*P＜0.05）

2.2 兩組小鼠不同時點BMD比較 術后2周去勢組小鼠BMD較假手術組明顯下降，而到了術后4周，去勢組和假手術組的差距更加明顯，兩組小鼠不同時點BMD比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 兩組小鼠不同時點Micro-CT數據比較及術后X線片檢查 假手術組和去勢組BV、BV/TV均有明顯下降，兩組術后2周和4周比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。雖然術后2周假手術組和去勢組Tb.Sp比較差異無統計學意義（P＞0.05），但術后4周去勢組Tb.Sp達到了（0.6000±0.0253）μm，相對于假手術組的（0.5064±0.0297）μm，差異有統計學意義（P＜0.05），而兩組術后2周和4周SMI比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。術后在分離股骨及去除髓內針時均無明顯內固定松動。圖2為術后4周去勢組小鼠的股骨在去除髓內釘后的X線片，可見骨折線為橫行骨折，而其余股骨的骨折形態也均為橫行或斜行骨折。

表1 兩組小鼠不同時點B MD比較（g/c m3）

表2 兩組小鼠不同時點Micro-C T數據比較

圖2 術后4周去勢組小鼠的股骨X線片

3 討論

女性原發性骨質疏松與絕經后雌激素的下降明顯相關。隨著女性年齡的增長，雌激素水平不斷下降，刺激成骨細胞的作用減弱，骨吸收作用增強，骨量嚴重丟失[6-7]。近年來，許多學科開展了雌性小鼠去除雙側卵巢建立骨質疏松動物模型的研究，并不斷探索在骨質疏松模型基礎上制作簡單有效的骨折模型[2]。本實驗從卵巢病理切片確認了操作的準確性，從血清雌激素水平的下降確認了骨質疏松模型的建立成功。

大鼠和小鼠的骨折模型在基礎實驗中已經廣泛運用[8-9]，上世紀80年代已有學者報道大鼠的閉合股骨骨折模型，可重復性好[10]。王希強等[11]曾提出徒手折骨造成大鼠股骨骨折，但是這對操作者的實驗操作要求較高，制造成橫形或斜形骨折的可重復性差。Marturano等[3]和張志平等[4]在其他學者建立的小鼠股骨骨折模型的基礎上設計了一種閉合性小鼠股骨骨折的模型。雖然該兩種方法可重復性好，形成橫形骨折模型的比例高，但該種造模方法需要專門的打擊器具，實驗操作比較繁瑣。Furuta等[7]則使用髓內固定，然后用線鋸造成橫行骨折，因此也有學者將此應用到小鼠股骨骨折的模型制作中，但該種方法僅在雄性小鼠中被證實應用可靠。雌性小鼠，尤其是骨質疏松性的雌性小鼠，該種內固定方式能否在一定的觀察時間段內維持有效的固定強度有待考證。本實驗在其他學者的基礎上采用髓內固定，直視下造成股骨中下1/3段骨折，術后X線片證實小鼠股骨均達到了橫形或斜形骨折的要求，證實該種內固定方式對雌性小鼠的骨質疏松性骨折固定療效可靠。且該種方法操作簡單，適于推廣。

Chow等[13]和Mansjur等[14]曾報道去除雙側卵巢后的雌性小鼠雌激素減退，并引起BMD、BV的下降，本研究發現去勢組小鼠術后2周和4周的雌激素水平明顯下降，且去勢組和假手術組小鼠相比，術后2周及4周BMD及BV明顯下降，差異均有統計學意義。但兩組小鼠SMI未見明顯改變，差異均無統計學意義。而Mansjur等[14]在制作雄性小鼠骨質疏松性骨折的模型時，發現SMI分別為2.1和1.3左右，差異有統計學意義。這可能是由動物選取的不同導致的。SMI代表的是結構模型指數，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，數值分別為0和3，即SMI值只在0～3之間變化[15]，發生骨質疏松時，板狀骨小梁向桿狀發展，SMI值將增大。Mansjur等[14]實驗選取的是7周齡的雄性小鼠，雄性相對于雌性，本身骨量丟失不明顯，且本實驗在小鼠12周齡時進行去勢，此時是小鼠由體成熟期往中老年期發展的一個階段，由于年齡因素，所以不管是假手術組和去勢組，兩者的SMI均接近于3，加上樣本量可能不夠大，導致該指標與其他文獻有所出入。本研究中12周齡的小鼠正處于體成熟期過度到中老年期的生理周期[16]，可以模擬中老年女性因絕經后引起的雌激素水平下降，同時Micro-CT相關數據也證實骨量的丟失。

骨折愈合是一個非常復雜的過程，包括了軟骨內成骨及膜內成骨兩種骨形成的方式[17]，其影響因素包括骨折局部的血運、年齡、健康狀況、醫源性因素等[18]。在骨折愈合過程，骨痂可較為直觀地評估骨折愈合情況，因為骨痂的形成和重塑可以恢復骨折前的強度與力學穩定[19]。本研究通過血清學研究、Micro-CT數據對小鼠骨折的愈合進行了動態觀察，可以發現雌激素水平低下的小鼠的骨痂的相關數據及愈合情況比假手術組差。證實該模型可以模擬中老年女性絕經后骨質疏松性骨折。

綜上所述，去除卵巢的雌性小鼠的雌激素水平、BMD、BV、BV/TV均明顯下降，同時Tb.Sp也明顯上升，骨折愈合情況較差，證實髓內固定開放性股骨骨折聯合去除雙側卵巢模擬中老年女性絕經后骨質疏松性骨折的小鼠動物模型建立成功。同時雌性小鼠骨質疏松性骨折的模型后雌激素的下降可以延遲骨折愈合，也能一定程度上模擬中老年女性絕經后骨質疏松性骨折的愈合情況。本實驗仍存在不足之處，本實驗的樣本量偏小，需要更大樣本去驗證。同時人體結構十分復雜，骨折愈合受多種因素影響，小鼠的骨折愈合與人體還是有一定的差別。另外，具體何種因素在調控或者影響骨質疏松性骨折愈合過程，還需要從細胞以及分子甚至信號通路等方面去進一步驗證。

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Establishment of a mouse osteoporotic fracture model

LI Weilong,YU Xiao,MAO Binyao,et al.Ningbo University School of Medicine,Ningbo 315211,China

Femalem ice Ovariectomy Osteoporotic fracture Animalmodel

2016-10-19）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2016-1676

浙江省醫藥衛生科技計劃重點項目（2015ZDA026）

315211 寧波大學醫學院（李偉龍）；寧波市第二醫院骨科中心（余霄、龐清江）；寧波市第一醫院骨科（毛賓堯）

龐清江，E-mail：pq je y@sina.com

【 Abstract】 Objective To estab lish a simp le and rep roducib le osteoporotic fracture model in m ice. Methods Fifty 12-week C57BL/6J female m ice were random ly divided into controlgroup(n=10),sham group(n=20)and modelg roup(n=20). Mice in control g roup were sac rificed after one week and the serum estrogen levels were measured.Mice in model group underwentbilateralovariectom y,while sham operation was given tom ice in sham group.Onemonth after operation,the left femur was exposed by lateral incision on left thigh ofm ice,intramedulary nailing was performed from knee joint for internal fixation,the lowerm idd le 1/3 section of the femurwas severed under d irect vision tomake a transverse or shortob lique fracture of the femur. At the week 2 and 4 after operation,the m ice in both g roups were sac rificed in batches(n=10 for each),serum estrogen levels weremeasured,bonem ineraldensity(BMD)was determ ined and the callus were exam ined w ith Micro-CT.Results The serum estrogen levels inmodelg roup were lower than those in sham g roup atweek 2 and 4 after operation(both P＜0.05).There were significantd ifferences in BMD,bone volume and relative volume frac tion between sham group and modelg roup atweek 2 and 4 afteroperation(all P＜0.05).Trabecula separation was significantly higher inmodelgroup than that in sham g roup atweek 4 after surgery(P＜0.05),while there was no significant d ifference in week 2(P＞0.05).There was no significantd ifference in structure model index between the two groups (P＞0.05). Conclusion Ovariectomy and intramedullary nailing is a simp le,intuitionaland stab lemethod for estab lishing a open osteoporotic femur fracturemodel inm ice,whichmay be used in laboratory study for postmenopausalosteoporotic fracture and bonemetabolism.