廣山藥總DNA提取方法的比較

高慧新 包道健 田 慧

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

廣山藥總DNA提取方法的比較

高慧新 包道健 田 慧*

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

目的：建立一種穩定高效獲得廣山藥總DNA基因組的提取方法，為同科屬及同類植物總DNA提取提供參考依據，便于應用分子生物學進行鑒定。方法：通過采用試劑盒法、改良CTAB法和SDS法對廣山藥的新鮮葉子、新鮮塊莖、干燥塊莖和新鮮嫩莖進行DNA提取，在進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法進行純度檢測。結果：3種方法均可以從不同的提取部位中提取到基因組DNA，但通過天根新型植物DNA提取試劑盒提取到的DNA純度最高，CTAB法次之，SDS法最差。結論：利用市售總DNA提取試劑盒提取DNA，方法簡便高效，所提DNA效果好。

廣山藥；DNA提??；試劑盒；CTAB；SDS

廣山藥來源于薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷DioscoreapersimilisPrain et Burkill[1]，又名廣西淮山，野生于海拔100～1950m的山坡、路旁、山谷雜木或灌叢中。我國南方各地也均有栽培，主產于廣西桂平、玉林、靈山、陸川、平南等[2]。褐苞薯蕷以根莖入藥，中醫用其補脾養胃、生津益肺、補腎澀精；壯醫用其“調谷道”氣道水道，補肺腎[1]。褐苞薯蕷在廣西、福建、海南等地被作為藥用與食用的山藥習用品由來已久[3]。褐苞薯蕷是重要的藥用植物資源，近年來，其以產量大、適應力強等優點，占據了藥材和食品市場的重要部分，充分說明了對其研究的必要性。

DNA分子標記技術是近年來應用在中草藥研究中的新技術，為中草藥基因圖譜建立、遺傳多樣性評估、分子標記輔助育種等研究提供了有價值的工具[4]。DNA提取是開展中藥材DNA分子標記研究的首要環節，實驗運用新型試劑盒法、CTAB法、SDS法，旨在避免大量的溶劑制備、方法和操作步驟的精簡及提高DNA質量，尋找一種能夠得到相對高產量、高純度的褐苞薯蕷總DNA的方法，對類似形態植物DNA 提取具有十分重要的意義，為后續褐苞薯蕷分子生物學研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 材料 廣山藥的新鮮葉子、新鮮根莖、新鮮嫩莖均采自廣西中醫藥大學仙葫校區，切取部分新鮮塊莖55℃烘干獲得干燥根莖。所采實驗材料經廣西中醫藥大學藥用植物教研室梁子寧副教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷Dioscorea persimilis Prain et Burkill。

1.2 試劑 新型植物總DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，生產批號：Q5118)，CTAB(生產批號：0504A16)，10%SDS(索萊寶，生產批號：20170328)，瓊脂糖(西班牙，生產批號：111860)，GelRed核酸染料(美國，生產批號：15G0611),Marker D2000(天根生化科技(北京)有限公司，生產批號：Q5317)，6×DNA loading buffer(索萊寶，生產批號：20160310), 其他所用試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 Eppendorf移液槍(德國)；電熱鼓風干燥箱(上海恒一)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣)；BSA224S電子天平(北京賽多利斯)；XW-80A旋渦混合器(上海滬西)；UV-1780紫外分光光度計(日本島津)；BIO-RAD電泳儀；BIO-RAD(Gel Doc XR+)凝膠成像系統。

2 方法

2.1 總DNA的提取

2.1.1 新型試劑盒法 按照試劑盒的操作步驟對各個部位進行總DNA的提取。

2.1.2 CTAB法 參照文獻[5-6]方法并進行改良，具體操作步驟為：①取實驗材料適量，除去表面污染，加液氮快速研磨至粉末狀；②將適量粉末轉移至65℃水浴預熱好的盛有800μLCTAB和12μLβ-巰基乙醇混合液的離心管中，旋渦混勻；③繼續在65℃水浴1.5h(期間顛倒混勻數次)；④從水浴中取出離心管，靜置冷卻至室溫，加入等體積的苯酚和氯仿，漩渦混勻，靜置5min,12000r/min離心15min；⑤吸取上清液轉移至新的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)，漩渦混勻，靜置5min, 12000r/min離心15min;⑥重復操作⑤；⑦取上清液轉移至新的離心管，加入等體積預冷的異丙醇，-20℃放置1h；⑧10000r/mim離心15min，棄上清液；⑨用75%的乙醇洗滌沉淀2次，10000r/min離心5min，棄乙醇；⑩將沉淀在室溫環境下晾干(應避免污染)，向離心管中加入200μL TE或ddH2O定容，-20℃保存備用。2.1.3 SDS法 參照文獻[7-8]并做適當調整，具體操作步驟如下：①取實驗材料適量，除去表面污染，加液氮快速研磨至粉末狀；②取適量粉末至65℃預熱好的盛有600μL CTAB提取緩沖液[100mMTris-HC1(pH8.0)50mM EDTA，0.5MNaC1，2%(w/v)PVP，用前加β-巰基乙醇至終濃度為2%]和1000μL 10%SDS的混合液中，旋渦混勻，繼續65℃水浴30min(期間顛倒混勻2～3次)；③將離心管從水浴中取出，靜置冷卻至室溫，12000r/min離心15min,將上清液轉移至另一新的離心管中；④向離心管中加入等體積的苯酚和氯仿，旋渦混勻，靜置5min，12000r/min離心15min，取上清液至新的離心管中；⑤向離心管中加入等體積的苯酚和氯仿∶異戊醇(24∶1)，旋渦混勻，靜置5min,12000r/min離心15min，轉移上清液至新的離心管中；⑥加入等體積的異丙醇，上下顛倒使其混勻，靜置待絮狀沉淀出現；⑦12000r/min離心5min，棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，10000r/min離心5min；⑧將沉淀置室溫晾干(應注意避免污染)，加入200μL TE或ddH2O溶解沉淀，置-20℃保存備用。

2.2 總DNA純度的檢測2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取所提取的DNA 7μL與適量6×DNA loading buffer混合，點樣于濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，100V電壓下電泳30min，用凝膠成像系統觀察并記錄圖像。

2.2.2 紫外分光光度法檢測 將提取得到的模板DNA做20倍稀釋(模板DNA50μL稀釋至1mL)后，用UV1780紫外分光光度計分別測定其在260 nm和280nm處的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值檢測其純度和濃度。

3 結果

3.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜 新鮮葉子和嫩莖的DNA條帶均比較明亮，新鮮根莖和干燥根莖的條帶不明顯。新型試劑盒法所提DNA沒有拖尾現象，不存在雜質。CTAB法和SDS法所提DNA條帶均存在嚴重拖尾現象，說明DNA發生了降解，這可能與兩種方法提取時間過長有關；從圖中結果可以很明顯看出，CTAB法和SDS法存在蛋白質和RNA雜質，SDS法雜質較CTAB法多。見圖1。

3.2 紫外分光光度法檢測 新型試劑盒法所提DNA的A260/A280的值均在1.8-2.0之間，說明DNA比較純；CTAB和SDS法所提DNA的A260/A280的值，有的大于2.0，有的小于1.8，說明DNA中有RNA和蛋白質殘留，這與凝膠電泳的結果是一致的。從濃度相比，新型試劑盒法的濃度最高，CTAB和SDS法濃度偏低。見表1。

表1 3種方法提取DNA檢測結果

4 討論

植物藥材除了具有細胞壁外，還存在大量的多糖、脂質、色素和酚類等物質，因此在植物DNA的提取和純化時，解聚核蛋白、去除蛋白質、酚類和多糖等物質是很重要的一步，故用不同的方法提取植物DNA效果是不一樣的。實驗中使用的CTAB法和SDS法都是比較傳統的提取DNA的方法，CTAB和SDS都是去污劑，都是通過裂解植物細胞，將蛋白質沉淀于有機試劑中，而核酸溶解于水相，再利用有機試劑多次抽提，從而達到去除蛋白質、多糖等物質，得到較純DNA的目的。新型試劑盒法是分子生物學發展的必然產物，試劑盒中的吸附柱有特殊的吸附膜，可以吸附DNA，經簡單的洗滌去除雜質就可獲得相對高純度的DNA。三種方法相比較，新型試劑盒法獲得的DNA純度和濃度高，實驗操作簡便，提取時間短，避免了有機試劑的配置，降低了有機試劑對實驗人員的安全隱患，符合高效穩定獲取廣山藥DNA的要求。

查閱文獻[9-11]可知，廣山藥中富含淀粉、蛋白質、氨基酸、多糖及礦物質等生物活性物質，是其營養價值和生物活性的物質基礎。從實驗結果中可知，CTAB法和SDS法提取的DNA中，都存在RNA和蛋白質等雜質的殘留，這可能與離心速率、試劑配置等有關，可以進一步優化實驗方案，如加入Rnase酶、增加抽提次數等。

根據不同方法對廣山藥總DNA提取的檢測結果，比較得出相對適合廣山藥總DNA提取的方法，便于利用分子標記方法對廣山藥進行鑒定。采用新型植物DNA提取試劑盒法提取的DNA純度和濃度都比其他兩種方法好。但在提取時也應注意：在漂洗吸附柱時，加入漂洗液后可靜置1 min 后再進行離心，這樣可以提高DNA的質量；實驗中必須要保證吸附材料是徹底晾干的，這樣可以避免漂洗液中的乙醇影響后續的反應(如PCR等)。

[1]廣西壯族自治區食品藥品監督管理局.廣西壯族自治區壯藥質量標準(第一卷)[M].南寧:廣西科技出版社,2008:43.

[2]鄧家剛，韋松基.廣西道地藥材[M].北京：中國中醫藥出版社，2007:15.

[3]高慧新,周敏,田慧,等.廣山藥的現代研究概況[J].解放軍藥學學報,2017,33 (1):72-74.

[4]任夢云,陳彥君,張盾,等.ISSR標記技術在藥用植物資源中的研究進展及應用[J].生物技術通報,2017,10(4):63-69.

[5]張馨元,趙超越,侯和勝,等.四種中藥材DNA提取方法的比較[J].中國生化藥物雜志,2015,35(7):17-21.

[6]于靜,盛萍,張帆,等.市售鹿茸片基因組DNA提取方法的比較[J].時珍國醫國藥,2016,27(4):880-882.

[7] 王淼,譚瑩,張麗華.中藥材貝母DNA不同提取方法的比較[J].北華大學學報(自然科學版),2011,12(6):662-665.

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Comparison of Total DNA Extraction Methods ofDioscoreapersimilisPrain et Burkill

GAO Huixin BAO Daojian TIAN Hui*

Guangxi University of Chinese Traditional Medicine, Nanning 530200,China

Objective To establish a stable and efficient method for the extraction of total DNA genome ofDioscoreapersimilisPrain et Burkill,and to lay the foundation for the extraction of total DNA of similar Chinese medicine, which is convenient for the identification of molecular biology. Methods DNA was extracted from fresh leaves, fresh tubers, dried tubers and fresh stems by using the Kit, modified CTAB method and SDS method, and subjected to agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometry for purity detection. Results Three kinds of methods could extract genomic DNA from different extraction sites, but the DNA purity was the highest by the DNAsecure Plant Kit of TIANGEN,CTAB method followed, SDS method is the worst. Conclusion The method of extracting DNA from the DNAsecure Plant Kit is simple and efficient, and the effect of DNA is good.

Rhizoma Dioscorea;DNA Extraction; Kit; CTAB; SDS

廣西中醫藥大學2015年度中藥學優勢學科建設課題(ZYX2015001)；壯瑤藥協同創新中心(桂教科研[2013]20號)；廣西壯瑤藥重點實驗室(桂科基字[2014]32號)；廣西重點學科壯藥學(桂教科研[2013]16號)；廣西八桂學者中藥創新理論與藥效研究(J13162)。

高慧新(1993-)，女，碩士研究生在讀，研究方向為中藥品種鑒定與質量評價。E-mail:2456658048@qq.com

田慧(1973-)，女，碩士研究生，教授，碩士研究生導師，研究方向為中藥品種鑒定與質量評價。E-mail:377244732@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2017)16-0027-03

2017-06-14 編輯：程鵬飛)