小白蒿總黃酮抗炎作用及其HPLC分離與NMR鑒定

圖布興 王青虎 白音木其爾 代那音臺(tái)

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟藥品器械采購(gòu)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 巴彥浩特鎮(zhèn) 750306；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

實(shí)驗(yàn)研究

小白蒿總黃酮抗炎作用及其HPLC分離與NMR鑒定

圖布興1王青虎2*白音木其爾2代那音臺(tái)2

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟藥品器械采購(gòu)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 巴彥浩特鎮(zhèn) 750306；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

目的：研究小白蒿總黃酮對(duì)甲醛致大鼠足腫脹模型的抗炎作用，并明確其主要化學(xué)成分。方法：采用甲醛致大鼠足腫脹模型觀察小白蒿總黃酮的抗炎作用，然后運(yùn)用HPLC法對(duì)其進(jìn)行分離并利用NMR法鑒定其分離物。同時(shí)，觀察小白蒿總黃酮的急性毒性。結(jié)果：小白蒿總黃酮在低劑量(50mg/kg)、中劑量(100mg/kg)和高劑量(200mg/kg)下表現(xiàn)出明顯的抗炎作用及劑量依賴性關(guān)系；根據(jù)小白蒿總黃酮的HPLC分離及NMR鑒定結(jié)果可知，其中主要含有5個(gè)黃酮類化合物，即5,3′-二羥基-3,6,7,4′-四甲氧基黃酮(S1)；5,7,3′-三羥基-6,4′-四甲氧基黃酮 (S2),；5,3′-二羥基-6,7,4′-三甲氧基黃酮 (S3),；5-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮-7-O- β-D- 葡萄糖醛酸苷 (S4)；5-羥基-3′,4″,5′-三甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(S5)。小白蒿總黃酮的LD50大于4.06 g/kg。結(jié)論：小白蒿總黃酮具有明顯的抗炎作用, 是小白蒿的主要抗炎有效部位之一。

小白蒿；總黃酮；抗炎作用；HPLC分析；NMR鑒定

小白蒿系菊科蒿屬植物冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.的地上部分，是歷代民間常用的燥“希日烏蘇” 特色蒙藥[1]。《四部醫(yī)典》中小白蒿能調(diào)理血液，兼燥“沙日烏蘇”而治療關(guān)節(jié)腫脹。現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床證明小白蒿為主劑的五味甘露湯對(duì)“希日烏蘇”病人治療關(guān)節(jié)腫脹和疼痛有明顯效果，尤其對(duì)熱性“希日烏蘇”病人，療效可達(dá)到90%以上[2-4]。

“希日烏蘇”(蒙醫(yī)體質(zhì)分類類型)[5]漢譯為黃水，它存在于全身各處，尤其在肌膚及關(guān)節(jié)較多。希日烏蘇出現(xiàn)偏盛偏衰和功能紊亂等反常狀態(tài)而導(dǎo)致病變稱之為“希日烏蘇”病。現(xiàn)代蒙藥藥理學(xué)[6]認(rèn)為，“希日烏蘇”蒙藥的主要藥理共性為抗炎作用，但目前對(duì)蒙藥燥“希日烏蘇”功效與抗炎作用的相關(guān)性方面的實(shí)驗(yàn)研究未見報(bào)道。然而，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者從炎癥的不同途徑和環(huán)節(jié)對(duì)中藥抗炎作用進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7-12]證實(shí)，我國(guó)的傳統(tǒng)中藥具有良好的抗炎功效，并且毒副作用小。所以，探索出具有民族特色的抗炎藥物的研究方向，尋找和發(fā)現(xiàn)適合于地區(qū)患者的抗炎新蒙藥是具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

前期研究結(jié)果[13-16]表明，小白蒿主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，相對(duì)含量約為10%，主要包括羥基化多甲氧基黃酮。近期研究[17-19]表明，羥基化多甲氧基黃酮比其全甲氧基化黃酮具有更強(qiáng)的生物活性，如抗炎活性和抗癌。故本研究在小白蒿中分離得到總黃酮的基礎(chǔ)上，首先采用甲醛致大鼠足腫脹模型觀察小白蒿總黃酮的抗炎作用，然后運(yùn)用HPLC法對(duì)其進(jìn)行分離并利用NMR法鑒定其分離物。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AUW220D型電子天平(日本島津)；HH-S26S 型水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；RE52-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海瀘西分析儀器廠)；Bruker AVAIVCEⅢ-300型核磁共振譜儀(布魯克公司)；日本島津液相色譜儀(LC-20Ap輸液泵，SPD-20A檢測(cè)器, CBM-20A工作站)；色譜柱為EZ0566。

1.2 試藥 醋酸地塞米松片(浙江仙據(jù)制藥有限公司)；羧甲基纖維素鈉(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)；D101大孔樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；氘代試劑為Cambridge Isotope Laboratories, InC；Sephadex LH-20 (Pharmacia 公司)，其它試劑均為分析純。小白蒿采集于內(nèi)蒙古通遼市，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院布和巴特爾教授鑒定為菊科蒿屬植物冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.的地上部分。標(biāo)本(No.20130720)保存于內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥化學(xué)教研室。

1.3 動(dòng)物 昆明種健康小鼠，雄雌各半，體重(20±2)g；Wistar 大鼠, 雄性, 體重200～300 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉林)-2011-0004。實(shí)驗(yàn)時(shí)的飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取 小白蒿粉末2.0kg，用75%乙醇50L回流提取兩次，每次3h，濾過，合并濾液。合并液減壓濃縮至干, 得到其提取物860g。提取物加水500mL，攪拌成混懸液。將處理好的D101樹脂500g，裝柱, 吸取混懸液，上柱，以3mL/min的流速進(jìn)行吸附，先用水5L洗脫，然后用20%乙醇溶液5L洗脫后再用85%乙醇溶液10L洗脫。85%乙醇洗脫液減壓回收至干，即得小白蒿總黃酮 (580.0g)。

2.2 HPLC分離與NMR鑒定 小白蒿總黃酮1.5g，精密稱定，加30%的乙腈水溶液50mL，超聲處理30min，過濾。濾液再用0.45μm的濾膜，過濾后備用。

色譜條件：流動(dòng)相為30%乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為5mL/min和進(jìn)樣量為200μL。在上述色譜條件下，進(jìn)樣，掃描，結(jié)果見圖1。HPLC分離得到化合物S1、S2、S3、S4和S5各15 mg溶解于5mL氘代二甲亞砜(DMSO-d6)中，測(cè)定其1H-NMR(500MHz, DMSO-d6)和13C-NMR (125MHz, DMSO-d6)數(shù)據(jù)，經(jīng)分析其NMR數(shù)據(jù)，確定了化合物的結(jié)構(gòu)式。結(jié)果見圖2。

化合物S1 淡黃色結(jié)晶(氯仿)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.9 (1H, s, 5-OH), 3.93 (3H, s, 7-OCH3), 3.91 (3H, s, 4′-OCH3), 3.89 (3H, s, 3-OCH3), 3.78 (3H, s, 6-OCH3), 6.91 (1H, s, H-8), 7.64 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.97 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5′), 7.60 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6′)。13C-NMR(DMSO-d6)δ: 151.3 (C-2), 137.0 (C-3), 178.2 (C-4), 151.8 (C-5), 131.1 (C-6), 158.5 (C-7), 91.7 (C-8), 155.7 (C-9), 105.5 (C-10), 122.3 (C-1′), 115.5 (C-2′), 147.9 (C-3′), 150.1 (C-4′), 112.3 (C-5′), 120.4 (C-6′), 56.3 (7-OCH3), 56.2 (4′-OCH3), 55.8 (3-OCH3), 55.2 (6-OCH3)。

化合物S2 淡黃色結(jié)晶(氯仿)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.7 (1H, s, 5-OH), 3.88 (3H, s, 4′-OCH3), 3.76 (3H, s, 6-OCH3), 6.56 (1H, s, H-3), 6.93 (1H, s, H-8), 7.52 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.95 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 7.56 (1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-6′)。13C-NMR(DMSO-d6)δ: 164.4 (C-2), 103.2 (C-3), 181.6 (C-4), 152.5 (C-5), 130.7 (C-6), 156.0 (C-7), 90.9 (C-8), 153.4 (C-9), 101.5 (C-10), 121.0 (C-1′), 112.6 (C-2′), 145.8 (C-3′), 149.6 (C-4′), 115.6 (C-5′), 120.5 (C-6′), 56.1 (4′-OCH3), 55.0 (6-OCH3)。

化合物S3 淡黃色結(jié)晶(氯仿)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.9 (1H, s, 5-OH), 3.94 (3H, s, 7-OCH3), 3.90 (3H, s, 4′-OCH3), 3.74 (3H, s, 6-OCH3), 6.60 (1H, s, H-3), 6.93 (1H, s, H-8), 7.60 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.94 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 7.61 (1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-6′)。13C-NMR(DMSO-d6)δ: 164.0 (C-2), 103.2 (C-3), 182.1 (C-4), 152.7 (C-5), 131.7 (C-6), 152.3 (C-7), 91.9 (C-8), 158.6 (C-9), 105.2 (C-10), 121.4 (C-1′), 115.7 (C-2′), 148.0 (C-3′), 150.8 (C-4′), 110.2 (C-5′), 120.5 (C-6′), 56.4 (7-OCH3), 56.1 (4′-OCH3), 55.1 (6-OCH3)。

化合物S4 黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.5 (1H, s, 5-OH), 3.93 (3H, s, 4′-OCH3), 3.90 (3H, s, 3′-OCH3), 6.93 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6), 6.95 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 7.63 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.98 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 7.60 (1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-6′), 5.09 (1H, d,J=7.0 Hz, H-1″)。13C-NMR(DMSO-d6)δ: 164.3 (C-2), 103.4 (C-3), 182.3 (C-4), 161.0 (C-5), 99.0 (C-6), 163.1 (C-7), 96.3 (C-8), 157.2 (C-9), 105.1 (C-10), 121.3 (C-1′), 115.7 (C-2′), 148.6 (C-3′), 149.7 (C-4′), 111.0 (C-5′), 119.8 (C-6′), 56.3 (4′-OCH3), 56.1 (3′-OCH3), 102.2 (C-1″), 73.1 (C-2″), 73.9 (C-3″),71.8 (C-4″), 76.5 (C-5″), 171.5 (C-6″)。

化合物S5 黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙醇。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.9 (1H, s, 5-OH), 3.91 (3H, s, 4′-OCH3), 3.89 (3H, s, 3′-OCH3), 3.89 (3H, s, 5′-OCH3), 7.03 (1H, s, H-3), 6.44 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6), 6.92 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 7.35 (1H, s, H-2′), 7.35 (1H, s, H-6′), 5.11 (1H, d,J=7.0 Hz, H-1″)。13C-NMR(DMSO-d6)δ: 164.1 (C-2), 103.9 (C-3), 182.0 (C-4), 161.2 (C-5), 99.4 (C-6), 163.1 (C-7), 95.3 (C-8), 156.7 (C-9), 105.1 (C-10), 120.3 (C-1′), 104.5 (C-2′), 148.2 (C-3′), 140.7 (C-4′), 148.2 (C-5′), 104.5 (C-6′′), 56.2 (3′,5′-OCH3), 59.6 (4′-OCH3), 103.1 (C-1″), 73.5 (C-2″), 74.1 (C-3″), 72.0 (C-4″), 76.6 (C-5″), 172.1 (C-6″)。

2.3 急性毒性研究 昆明種健康小鼠，雄雌各半，50只，按體重隨機(jī)分為5個(gè)組。劑量設(shè)置如下：第1組0.52 g/kg、第2組1.02 g/kg、第3組2.10 g/kg、第4組3.12 g/kg、第5組4.06 g/kg。動(dòng)物禁食不禁水16h后，一次性灌胃給藥0.2 mL/10 g體重，樣品用0.5%CMC-Na溶解。觀察14d，記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)、死亡情況及死亡動(dòng)物解剖臟器病變。結(jié)果給藥后14d內(nèi)，各劑量組無小鼠死亡，無明顯毒性反應(yīng)，14d后解剖無可見臟器病變。小白蒿總黃酮的LD50大于4.06 g/kg。

2.4 對(duì)甲醛致大鼠足腫脹的影響 按每組大鼠重量計(jì)算給藥量，然后加適量的0.5%CMC-Na溶解，即得。按文獻(xiàn)[20]方法，雄性Wistar 大鼠50只，隨機(jī)分為5個(gè)組。空白對(duì)照組(0.5%CMC-Na，10 mL/kg)、陽性對(duì)照組(地塞米松，2.5 mg/kg)、給藥組低劑量(小白蒿總黃酮，50 mg/kg)、中劑量(小白蒿總黃酮，100 mg/kg))和高劑量(小白蒿總黃酮，200 mg/kg)。測(cè)量致炎前大鼠正常足體積2次，取其平均值。各組每天1次灌胃給藥1mL/100 g，連續(xù)7d。最后一次給藥1h后，右后足跖腱膜下注射2%甲醛0.1mL致炎，左后足相同部位注射0.1mL生理鹽水(NS)作對(duì)照。同時(shí)，每只大鼠灌胃給藥5mL NS行水負(fù)荷。致炎后1h、2h、6h、12h、24h分別測(cè)定大鼠足體積。以左右足容積之差表示足腫脹度，由表1可知，在200mg/kg劑量下，小白蒿總黃酮能抑制甲醛致炎后1h、2h、6h、12h、24h的足腫脹，其抑制率為21.34%～35.41%，且具有明顯的量效關(guān)系。

組別劑量腫脹度/mL(抑制率/%)1h3h6h12h24h空白組-0.492±0.0970.566±0.1470.633±0.1920.669±0.2390.658±0.224陽性組2.5mg/kg0.330±0.139*(32.93)0.369±0.136**(34.81)0.365±0.177**(42.34)0.371±0.214***(44.54)0.355±0.280*(46.05)低劑量組50mg/kg0.452±0.068(8.13)0.515±0.102(9.01)0.557±0.114(12.01)0.563±0.166(15.84)0.532±0.166(19.15)中劑量組100mg/kg0.424±0.115(13.82)0.484±0.13(14.49)0.534±0.209*(15.17)0.548±0.218*(18.09)0.491±0.204(25.38)高劑量組200mg/kg0.387±0.115*(21.34)0.433±0.197*(23.50)0.464±0.234**(26.70)0.463±0.195**(30.79)0.425±0.293*(35.41)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

根據(jù)小白蒿總黃酮的HPLC分離與NMR鑒定結(jié)果可知，其主要含有5個(gè)黃酮類化合物，分別是5,3′-二羥基-3,6,7,4′-四甲氧基黃酮(S1), 5,7,3′-三羥基-6,4′-四甲氧基黃酮(S2), 5,3′-二羥基-6,7,4′-三甲氧基黃酮(S3), 5-羥基-3′,4′-二甲氧基黃酮-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷(S4), 5-羥基-3′,4′,5′-三甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(S5)。以上均為羥基化多甲氧基黃酮，這類黃酮比其全甲氧基化黃酮具有更強(qiáng)的抗炎作用[17-19]，故可能是小白蒿總黃酮的主要抗炎活性成分。

實(shí)驗(yàn)明確了小白蒿總黃酮的主要化學(xué)成分及抗炎作用，但對(duì)其化學(xué)成分的抗炎作用及機(jī)制尚未清楚，有待于下一步的研究。然而，從蒙醫(yī)臨床上來看,該藥多年用來治療關(guān)節(jié)腫脹和疼痛等熱性“希日烏蘇”病人的經(jīng)驗(yàn)也驗(yàn)證了小白蒿具有一定的抗炎作用。

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Anti-inflammatory Effects, HPLC Isolation and NRM Identification of the Total Flavonoids fromArtemisiafrigida

Tubuxing1WANG Qinghu2*Bai Yinmuqier2Dai Nayintai2

1. Alashan pharmaceutical equipment procurement service center, Bayanhaotezhen750306, China;2.College of Traditional Mongolian Medicine,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028000,China

Objective To study the anti-inflammatory effects of total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld on inflammation in rats, and determine the main chemical components. Methods The anti-inflammatory effects of total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld on the model of paw edema in rats induced by formaldehyde and then the HPLC and NMR were used to carry on the isolation and identification of 1it’s chemical components. At the same time, the acute toxicity of total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld was observed. Results At the doses used total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld (50, 100, and 200 mg/kg) showed significant and dose-dependent anti-inflammatory effects. According to the HPLC isolation and NMR identification of the total flavonoids fromA.FrigidaWilld, there are five major compounds, namely 5,3′-dihydroxy-3,6,7,4′-tetramethoxy flavone (S1), 5,7,3′-trihydroxy-6,4′-dimethoxyflavone (S2), 5,3′-dihydroxy-6,7,4′-trimethoxyflavone (S3), 5-hydroxy-3′,4′-dimethoxy-7-O- β-D- glucuronide (S4), 5-hydroxy-3′,4′,5′-trimethoxy-7-O-β-D-glucuronide (S5). The LD50of total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld was more than 4.06 g/kg. Conclusions The total flavonoids fromArtemisiafrigidaWilld has significant anti-inflammatory effects, which is one of the main active parts ofArtemisiafrigidaWilld.

ArtemisiaFrigidaWilld; Total Flavonoids; Anti-inflammatory; HPLC Isolation; NMR Identification

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8146054)。

圖布興(1975-)，男，蒙古族，學(xué)士，副主任蒙藥師，研究方向?yàn)槊伤庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：myycdx@163.com

王青虎(1968-)，男，蒙古族，博士研究生，教授，研究方向?yàn)槊伤幱行镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: wqh693@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)16-0040-04

2017-06-20 編輯：程鵬飛)