人胃癌細胞系的建立及其評價

葛曉梅, 張一心, 謝付波, 劉繼斌, 楊 磊, 渠穎穎,顧 瑩,5, 李學廷, 楊偉敏, 劉喜朋, 周 禾,5, 強福林

(1. 上海睿智化學研究有限公司, 上海 201203; 2.上海交通大學, 上海 200240;3. 南通市腫瘤醫院, 南通 226361; 4. 藥物轉化工程技術研究中心, 上海 201203;5. 開拓者醫學研究(上海)有限公司, 上海 201203)

·論 著·

人胃癌細胞系的建立及其評價

葛曉梅1,2, 張一心3, 謝付波1,4, 劉繼斌3, 楊 磊3, 渠穎穎1,顧 瑩1,5, 李學廷1, 楊偉敏1, 劉喜朋2, 周 禾1,4,5, 強福林3

(1. 上海睿智化學研究有限公司, 上海 201203; 2.上海交通大學, 上海 200240;3. 南通市腫瘤醫院, 南通 226361; 4. 藥物轉化工程技術研究中心, 上海 201203;5. 開拓者醫學研究(上海)有限公司, 上海 201203)

目的 利用已建立的胃癌人源化異種移植瘤 (Patient-derived xenograft, PDX) 模型建立胃癌細胞系，并對建立的胃癌細胞系進行生物學特性評價。方法 選擇12例生長狀態良好的胃癌PDX模型，待小鼠移植瘤體積生長至500～900 mm3時，取出腫瘤組織進行癌細胞的原代培養建立細胞系，通過細胞形態學觀察、染色體分析、短片段重復序列(STR)分析、免疫組織化學染色、體外藥敏及體內成瘤實驗對其生物學特性進行分析鑒定，并在此基礎上利用建立成功的胃癌細胞系進行化療藥物藥效學評價。結果 12例PDX模型中共成功建立6例胃癌細胞系，細胞系可穩定多次傳代。選擇其中2例胃癌細胞系(GAXC031和GAXC066)進行生物學特性鑒定。遺傳學結果證實，這2例細胞系來自親本PDX模型，符合惡性胃癌的遺傳學特征，在裸小鼠體內具有致瘤性。由細胞系建立的移植瘤模型在保留主要臨床生物學特征的前提下，具有成瘤率高，潛伏期短，生長均一性好等特點。體外和體內藥敏實驗結果均表明，GAXC031對5-氟尿嘧啶有一定的敏感性[體外半抑制濃度(IC50)為0.265 μmol/L, 體內腫瘤生長抑制率(TGI)為30%～50%], 而GAXC066不敏感(體外 IC50為＞200 μmol/L, 體內 TGI＜0); 2 例細胞系對順鉑的敏感性均較強(TGI＞60%)。結論 成功建立了6例人源胃癌細胞系。對GAXC031和GAXC066細胞系全面的分析和鑒定顯示，細胞系與親本PDX模型高度相關。細胞系體內外藥敏實驗結果顯示，對同一個化療藥物，其體內與體外數據間存在很高的一致性。這些細胞系及相關模型可用于抗癌藥物的研發和腫瘤基礎研究。

人源化異種移植瘤(PDX); 胃癌; 細胞系; 生物學特性; 藥效學實驗

胃癌是全球發病率最高的癌癥之一，在惡性腫瘤的死亡病因中高居第2位, 僅次于肺癌[1,2]。近年來，雖然胃癌的全球發病率有所下降，但相比于西方國家，亞洲的發病率仍然很高[3-5]。中國是胃癌發病率最高的國家之一，胃癌的新發病例已占全球的40%以上[6]。據全國腫瘤登記中心統計顯示無論城鄉，胃癌的發病率和死亡率都居高不下[7]

目前胃癌的治療模式已經從單一的手術治療進入綜合治療加規范化手術的新治療模式，其中輔助化療作為綜合治療方法之一，已得到越來越多的關注[2,8]。盡管對于早期胃癌患者而言, 施行手術治療可使其5年生存率達到90%以上, 但遺憾的是早期胃癌的診斷率卻不足10%[9,10]; 而進展期胃癌由于其手術切除率比較低，聯合應用綜合治療后雖然可明顯提高其5年生存率, 但患者的預后仍然比較差[11]胃癌臨床化療往往會面臨以下問題： 首先，常用的化療方案缺乏客觀指標反應藥物的抗癌敏感性[12]; 其次，耐藥現象的發生仍然是胃癌化療中存在的最大問題[13,14]。盡管人們已經在抗癌藥物的篩選及克服化療藥物耐藥性方面做了很多的研究，但至今這些問題還未得到根本解決。鑒于此，建立與臨床腫瘤病理表現相同的胃癌細胞系，可為臨床前藥物的篩選和臨床耐藥現象的研究提供重要的實驗材料。

由于直接運用臨床腫瘤組織建立腫瘤細胞系成功率比較低, 因此, 通過運用臨床腫瘤標本先建立動物腫瘤模型，進而通過原代培養建立人源腫瘤細胞系更具有可行性，同時也接近于腫瘤的臨床生物學特性, 對藥物的耐藥性及敏感性具有良好的預測性，而且也有效地彌補了人源化腫瘤異種移植模型用時長、通量低、均一性差、難以進行機理研究等弱點。另外利用這些細胞系還可建立體內移植瘤模型, 進而可以獲得體外、體內兩個相關聯的藥物篩選平臺。因此, 本研究選擇12例生長狀態良好的胃癌患者原代腫瘤異種移植(PDX)模型, 通過原代培養,建立了人胃癌細胞系, 對其生物特性進行分析鑒定,并利用所建立的細胞系進行體內體外藥效學評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/c裸小鼠共110只，5～6周齡，體質量16～19 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司 [SCXK(京)2012-0001], 飼養于上海睿智化學研究有限公司SPF動物實驗設施[SYXK (滬) 2012-0030],適應一周后開始實驗。

1.2 主要試劑和藥物

HBSS緩沖液、RPMI-1640培養液、胎牛血清購自美國Invitrogen公司; DNA提取試劑盒購自美國Axygen公司; anti-CEA、anti-Cytokeratin、anti-Vimentin、anti-CA19-9購自美國Santa Cruz公司;anti-HER-2購自美國Cell Signaling公司; DAB試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司; CellTiter Glo試劑盒購自美國Promega公司; 基質膠Matrigel購自美國BD公司; 秋水仙素、5-氟尿嘧啶(貨號47576)、奧沙利鉑(貨號09512)、伊立替康(貨號I1406)購自美國Sigma公司; 順鉑購自江蘇豪森藥業股份有限公司(國藥準字H20040813); 多西紫杉醇購自美國Fluka公司(貨號 01885)。

1.3 腫瘤組織來源

本研究中所有胃癌腫瘤組織均從上海睿智化學研究有限公司成功建立的PDX獲得[15]。腫瘤組織最初的獲取和相關處理通過上海睿智化學研究有限公司倫理委員會的審核。

1.4 細胞原代培養

從胃癌PDX模型庫中選擇12例生長狀態較好的模型, 待裸小鼠體內移植瘤體積增長至500～900 mm3時, 對荷瘤鼠施行安死術。在無菌條件下，取出腫瘤組織后去除黏膜組織及血管，將腫瘤組織切成小塊，用腫瘤細胞消化液重懸, 并置于37 ℃搖床上消化2～4 h, 70 μm濾膜過濾, 紅細胞裂解液裂解紅細胞，淋巴細胞分離液(Histopaque)純化腫瘤細胞后，向培養瓶內加入含有5%胎牛血清, 100 U/mL青霉素G，100 μg/mL硫酸鏈霉素和0.25 μg/mL兩性霉素B的RPMI-1640培養基，在37 ℃、體積分數5% CO2恒溫培養箱中靜置培養。當細胞鋪滿培養瓶底約70%時，傳代細胞同時利用成纖維細胞與腫瘤細胞貼壁速率不同對細胞進行純化，如此反復進行直至將成纖維細胞去除。培養過程中避免腫瘤細胞間的交叉污染。

1.5 細胞形態學觀察

將生長狀態良好的細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，有無污染情況, 并進行顯微攝影。

1.6 染色體數目鑒定

將純化后的細胞分別置于37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養12 h后, 加入0.4 μg/mL秋水仙素,再繼續培養10 h。采集分裂中期的細胞, 向細胞中加入0.075 mol/L的KCl低滲溶液, 37 ℃孵育20～30 min,離心棄上清液，用新鮮配制的固定液(甲醇∶乙酸=3：1)固定30 min，離心后用PBS重懸細胞，將細胞懸液滴于預冷的載玻片上，用Giemsa染色液染色10min，清水沖洗，晾干，封片，在顯微鏡下計數染色體數目。

1.7 短片段重復序列(STR)鑒定

分別收集新鮮培養的細胞, 用試劑盒提取細胞基因組DNA, 用5'端熒光標記的引物進行PCR擴增,對所得產物進行測序, 分析包括Amelogenin, THO1,TPOX, D13S317, vWA, D16S539, D5S818, CSF1PO以及D7S820等各個STR位點的序列重復數。

1.8 組織來源鑒定

將培養的細胞分別接種在蓋玻片上進行培養，等細胞伸展后, 用質量分數4%甲醛固定過夜后，將固定液吸棄, 并使用PBS進行漂洗。透化處理細胞膜后加入封閉液封閉30 min, 然后加入適量一抗(anti-CEA, anti-Cytokeratin, anti-Vimentin, anti-CA19-9,anti-HER-2)4℃孵育過夜, 加入二抗室溫孵育30 min后, 進行DAB染色。封片后使用ScanScope(Aperio)切片掃描系統進行掃描。

1.9 體外細胞毒性實驗

體外測定胃癌臨床常用的化療藥物： 5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑、多西紫杉醇和依立替康對細胞的抗增殖作用。分別將受試細胞以3000個/孔的密度接種在96孔板中, 加入不同濃度梯度的藥物, 各藥物終濃度梯度分別為： 5-氟尿嘧啶(200.00 μmol/L、50.00μmol/L、12.50μmol/L、3.13μmol/L、0.78μmol/L、0.20 μmol/L); 順鉑(200.00 μmol/L、50.00 μmol/L、12.50 μmol/L、3.13 μmol/L、0.78 μmol/L、0.20 μmol/L);奧沙利鉑(100.00 μmol/L、25.00 μmol/L、8.33 μmol/L、2.78 μmol/L、0.93 μmol/L、0.31 μmol/L); 多西紫杉醇(4.00 μmol/L、0.80 μmol/L、0.16 μmol/L、0.03μmol/L、0.01 μmol/L、0.001 μmol/L); 依立替康(200.00 μmol/L、66.67μmol/L、22.22μmol/L、7.41μmol/L、2.47μmol/L、0.82 μmol/L), 每個濃度設立三個復孔, 培養72 h后，用CellTiter Glo試劑盒測定細胞活力，利用XLFit軟件計算半數抑制濃度(IC50)。

1.10 體內生長曲線及組織學觀察

分別收集細胞并制成懸液, 雙側皮下接種至5只裸小鼠, 接種的細胞量視細胞生長速率而定。接種后注意觀察腫瘤的生長情況，每周對小鼠體質量進行稱量。待腫瘤生長至可測量時, 使用游標卡尺每周定期測量腫瘤的長(a)與寬(b)。待實驗結束時，用過量的CO2麻醉荷瘤小鼠并施行安死術，將腫瘤剝離, 先大體觀察剝離的腫瘤, 使用質量分數4%中性甲醛固定液固定腫瘤組織, 然后進行石蠟包埋、切片及HE染色，并在光學顯微鏡下進行觀察。

1.11 體內藥效實驗

體外收集對數期細胞, 各接種至50只裸小鼠單側皮下。待腫瘤長至合適體積(100～300 mm3)時，挑選腫瘤形狀比較規則且體積比較接近的小鼠進行隨機分組，每組小鼠8～10只，腹腔給藥，共3組： 對照組; 5-氟尿嘧啶組，25 mg/kg連續給藥5 d后停藥2 d; 順鉑組，5 mg/kg每周給藥一次。分組當日開始給藥，給藥前稱量并記錄小鼠體質量，共給藥2周。給藥后每周定期測量小鼠腫瘤體積。

1.12 數據分析

小鼠腫瘤體積(TV)計算公式為： TV=1/2ab(a、b分別為腫瘤長徑和短徑), 根據所得數值來繪制腫瘤生長曲線。針對每一例人胃癌細胞系體內移植瘤模型, 使用腫瘤生長抑制率(TGI)作為藥效實驗評價指標, 計算公式為： TGI%=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100, (Ti： 給藥組當日測量的TV; T0： 給藥組分組時的TV; Vi： 對照組當日測量的 TV; V0： 對照組分組時的TV)。實驗結果以x- ± s表示, 并使用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析, 兩組內數據的比較采用Two-way ANOVA檢驗, P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 建立的人胃癌細胞系相關信息

12例人胃癌PDX模型共成功建立6例細胞系(表1)，這些細胞系性狀都比較穩定，能在體外長期生長和穩定傳代。

表1 12例胃癌PDX模型相關信息Table 1 The information of 12 gastric cancer PDX models

2.2 胃癌細胞系呈惡性生長

以細胞系GAXC031和GAXC066為例，顯微鏡下可見體外生長的GAXC031細胞呈惡性生長有重疊生長，貼壁生長部分呈扁平狀，無明顯接觸抑制；體外生長的GAXC066主體細胞呈大柳葉形，無明顯接觸抑制特性(圖1)。

2.3 染色體畸變嚴重

圖1 倒置顯微鏡下人胃癌細胞系的細胞形態 (100×)Figure 1 Cell morphological observation of human gastric cancer cell lines under Inverted microscope (100×)

圖2 細胞系GAXC031和GAXC066染色體分析結果 (1000×)Figure 2 Chromosome analysis of GAXC031 and GAXC066 cell line (1000×)

細胞系GAXC031和GAXC066在經過連續傳代后，染色體仍保持人源性腫瘤細胞染色體的特征，表現為多倍體。GAXC031染色體總數為79±3, 占71.29%, 表現為高異倍性; GAXC066染色體總數為51±2, 占80.89%, 表現為超二倍體。二者均存在多數中央及亞中央著絲粒染色體, 且染色體數目和結構畸變嚴重, 符合人惡性腫瘤的遺傳學特征(圖2)。

2.4 STR具有細胞系特異性

對細胞系GAXC031和GAXC066的Amelogenin,THO1, TPOX, D13S317, vWA, D16S539，D5S818,CSF1PO以及D7S820等各個STR位點的序列重復數進行分析，其中STR位點的拷貝數如表2所示，并與其親本PDX組織的STR結果進行比對分析。由表可見, 這2例細胞系的各個位點數目與其親本PDX組織的基本保持一致, GAXC031與GAX031僅在vWA存在細微差異(GAXC031的序列重復數為16, 而GAX031為16和17), 而GAXC066與GAX066也僅在D13S317存在稍許不同(GAXC066的序列重復數為10, 而GAX066為7和10)。據此可以判定這2例細胞系來自其相應的親本PDX腫瘤。上述序列和ATCC, DSMZ等細胞庫的數據進行查詢比對，未返回相同的遺傳圖譜。由此可以證明細胞系的獨一無二性，且在原代培養過程中未發生和其他細胞的交叉污染。

2.5 免疫組織化學染色表現為胃腺癌

細胞系GAXC031和GAXC066免疫組織化學染色結果相似。以GAXC066為例，結果如圖3所示，其中Vimentin為強陽性；Cytokeratin為強陽性，CA19-9為陽性，提示其腫瘤類型與腺癌相關；CEA為強陽性，提示該細胞系惡性程度較高；HER-2表達常見于腺癌而少見于鱗癌，表達為弱陽性。結合其來源組織的臨床信息和病理診斷結果，判斷該細胞來源于胃腺癌。

表 2 細胞系GAXC031和GAXC066的STR 位點拷貝數Table 2 Copies of STR for GAXC031 and GAXC066 cell line

2.6 各化療藥物對細胞系GAXC031和GAXC066的藥物敏感性

各化療藥物對細胞系GAXC031和GAXC066的IC50值如表3所示, 生長抑制曲線如圖4所示。對5-氟尿嘧啶而言, GAXC031對其敏感性較強, 而GAXC066的敏感性則比較弱; 細胞GAXC031和GAXC066對順鉑敏感; GAXC031對奧沙利鉑的敏感性明顯大于GAXC066; 伊立替康對這2例細胞的生長抑制作用相當, IC50均在 25～40 μmol/L; 而化療藥物多西紫杉醇對這2例細胞的敏感性較強，IC50值均比較低。

2.7 胃癌細胞系具有強致瘤性

細胞系GAXC031和GAXC066接種到小鼠皮下1周后開始生長，成瘤率均高達90%以上。腫瘤潛伏期(腫瘤體積達到100～300 mm3所需要的時間較親本PDX模型縮短2～3周。細胞系的成瘤率和生長均一性相對其親本PDX模型(成瘤率60%左右都有所提高。

HE染色結果顯示，細胞系移植瘤的組織形態均高度接近其來源組織瘤塊，且病理診斷結果均為低分化胃腺癌, 以GAXC066為例, 結果如圖5所示

2.8 體內成瘤組織對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性

圖3 細胞系GAXC066免疫組織化學染色結果 (200×)Figure 3 Immunohistochemical analysis of GAXC066 cell line (200×)

表 3 各化療藥物對細胞系GAXC031和GAXC066的IC50Table 3 IC50 of chemotherapy drugs on GAXC031 and GAXC066 cell line μmol/L

經過13～14 d給藥后，給藥組與對照組相比5-氟尿嘧啶對GAXC031腫瘤的生長具有一定的抑制作用, 而順鉑對其具有較強的抑制作用(P＜0.05)并且這2個化療藥物在GAXC031與GAX031中的敏感性保持一致，具有高度相關性; 順鉑對GAXC066具有較強的敏感性(P＜0.05)，而5-氟尿嘧啶對其不敏感(P＞0.1)，與GAX066體內藥效實驗具有一定的相似性，但并沒有表現出完全的一致性(圖6)，可能與親本GAX066模型具有更高的異質性有關。

圖4 各化療藥物對細胞系GAXC031和GAXC066的生長抑制曲線Figure 4 The growth inhibition of chemotherapy drugs on GAXC031 and GAXC066 cell line

圖5 GAXC066移植瘤的組織形態觀察Figure 5 Observation on histomorphology of GAX066 xenograft tumor

3 討論

我國胃癌發病率比較高, 其病因尚不完全清楚,其高發區主要集中在西北及沿海的各省市，如甘肅省、上海市和江蘇省等地[17]。本研究在建立細胞系時所使用的腫瘤模型均來源于江蘇省南通市腫瘤醫院的臨床腫瘤標本[15], 這為研究具有區域特異性胃癌的發生與發展及治療提供了理想的體外研究模型,而且選取的12例胃癌PDX模型均為腺癌, 這與中國人群中胃癌患者的病理分布情況也是相符合的[16]。

本研究所建立的細胞系GAXC031和GAXC066性狀均比較穩定, 可以穩定多次傳代, 具有成瘤性強、潛伏期短、均一性較好等優點。在遺傳學和病理學方面高度接近原腫瘤組織，很好保持了腫瘤的臨床生物學特性，這對于抗癌藥物的療效具有很好預測性，同時由于腫瘤來源于中國人群，比較符合中國人的遺傳特征，因此，這些新建立的細胞系對研發適合中國人的抗胃癌新藥具有十分重要的理論和臨床意義，是胃癌研究理想的實驗材料。

圖6 體內5-氟尿嘧啶和順鉑對成瘤組織的生長抑制作用Figure 6 In vivo tumor growth inhibitions of 5-Fu and Cisplatin on gastric cancer xenograft models

針對化療藥物5-氟尿嘧啶和順鉑而言，細胞系GAXC031和GAXC066體內與體外藥物敏感性相似，這說明體內與體外數據間存在較高的相關性。體外藥敏實驗表明，GAXC031和GAXC066對5-氟尿嘧啶的敏感性差異較大，在體內藥效實驗中對腫瘤生長的抑制效果也具有明顯的差異性；而在體外藥敏實驗中對順鉑的敏感性無明顯差異，在體內藥效實驗中對順鉑的反應性也區別不大。通過體內藥效實驗相比，GAXC031與GAX031對5-氟尿嘧啶和順鉑的反應性具有高度的相關性，對于化療藥物的初步篩選具有很大的意義。

由于在胃癌治療過程中，鉑類聯合氟尿嘧啶類化療一直是一線且唯一的臨床推薦方案，所以取得合適的研究材料以加深對5-氟尿嘧啶和順鉑耐藥機制的了解，有助于解決胃癌化療中耐藥現象產生的問題，進而大大提高胃癌的化療效果，對胃癌的臨床治療具有非常重要的意義。對于細胞系GAXC066而言，在體內與體外實驗中對5-氟尿嘧啶均表現出顯著的耐藥性。已有文獻[18-20]指出5-氟尿嘧啶的治療效果與其代謝分解相關的靶向酶胸苷酸合成酶 (thymidylate synthase, TS)和二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD) 呈負相關，其耐藥的發生可能是與此類酶的表達以及基因多態性有關。但是到目前為止，5-氟尿嘧啶耐藥的確切分子機制還不十分明確。因此，細胞系GAXC066非常適用于研究5-氟尿嘧啶的耐藥機制，本研究中所建立的人胃癌細胞系對于有效指導臨床研究也具有重要作用。

傳統的腫瘤細胞系及移植瘤模型在藥物研發中被廣泛用于藥物篩選。但由于長期體外培養，傳統細胞系逐漸喪失了很多疾病特征，藥效與臨床存在很大的差異, 極大影響了藥物研發進程。2016年初美國國家癌癥研究所(NCI)宣布，于2016年春季末正式廢棄已經被世界各地的研究人員使用了長達25年之久的NCI-60細胞系，取而代之的是PDX模型及相關原代細胞系[21]。PDX模型是將患者腫瘤組織塊接種到免疫缺陷小鼠中，與傳統細胞系建立的動物模型相比，減少了體外培養步驟，保持臨床腫瘤的形態和分子學特征，因而用該模型做的藥效結果更具有臨床預測性。同時PDX模型接近于腫瘤的臨床生物學特性，對藥物的耐藥性及敏感性具有良好的預測性，是輔助精準化醫療的有效工具之一。但PDX模型用時長、通量低、均一性差、難以進行大規模的藥物篩選和機理研究。從PDX模型建立腫瘤原代細胞系，保持了PDX模型的基因和區域特性，同時可以像傳統的細胞系一樣在體外傳代擴增，在很大程度上克服了PDX模型的缺陷。另外利用這些細胞系還可建立體內移植瘤模型，可以獲得體外、體內兩個相關聯的藥物篩選平臺。本研究通過PDX模型腫瘤細胞原代培養，成功建立了人胃癌細胞系，對其生物特性進行分析鑒定，證實這些細胞系及移植瘤模型與親本PDX模型相關性極好, 可以作為PDX模型的補充。但必須指出，從PDX模型建立的腫瘤原代細胞系與PDX模型相比異質性降低，所以藥物敏感性上與PDX模型可能存在不同。本研究中5-氟尿嘧啶在GAX066 PDX模型有一定療效，但對GAXC066細胞及移植瘤模型幾乎沒有任何療效。提示PDX模型來源的腫瘤細胞系不能完全替代PDX模型，需要和PDX模型結合使用。

綜上所述, 本研究成功建立了PDX模型來源的胃癌細胞系，基本保持了PDX模型的特性，為胃癌的相關基礎研究和藥物研發提供了更多的工具。

[1] Cidon EU, Centeno RG, Lagarto EG, et al. HER-2 evaluation in a specific gastric cancer population with the highest rate of mortality in Spain[J]. J Oncol, 2011：391564[Epub 2011 Oct 27].

[2] Ye H, Jing YF, Shu DX. Can the incidence of gastric cancer be reduced in the new century[J]. J Digest Dis, 2013, 14(1)：11-15.

[3] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2)：69-90.

[4] He YT, Hou J, Chen ZF, et al. Trends in incidence of esophageal and gastric cardia cancer in high-risk areas in China[J]. Eur J Cancer Prev, 2008, 17(2)：71-76.

[5] Jin H, Pinheiro PS, Callahan KE, et al. Examining the gastric cancer survival gap between Asians and whites in the United States[J]. Gastric Cancer, 2016 [Epub ahead of print].

[6] 劉天藝, 焦宇飛. 胃黏膜活檢標本中上皮內瘤變及早期癌的病理診斷[J]. 中華病理學雜志, 2014, 43(9)：644-646.

[7] 王江紅, 項穎. 早期胃癌的篩查現狀及診斷進展[J]. 重慶醫學, 2009, 38(20)：2634-2636.

[8] Dan Liu, Ming Lu, Jian Li, et al. The patterns and timing of recurrence after curative resection for gastric cancer in China[J]. World J Surg Oncol, 2016, 14(1), 305.

[9] Binn M, Ruskonéfourmestraux A, Lepage E, et al. Surgical resection plus chemotherapy versus chemotherapy alone：comparison of two strategies to treat diffuse large B-cell gastric lymphoma[J]. Ann Oncol, 2003, 14(12)：1751-1757.

[10] Moelans CB, Milne AN, Morsink FH, et al. Low frequency of HER2 amplification and overexpression in early onset gastric cancer[J]. Cell Oncol (Dordr), 2011, 34(2)：89-95.

[11] Liu KH, Hung CY, Lu CH, et al. Survival outcomes of geriatric patients with clinically resectable gastric cancer： to operate or not[J]. J Surg Res, 2016, 206(2)：481-489.

[12] Thiel A. Targeted therapy in gastric cancer[J]. APMIS, 2015,123(5)：365-372.

[13] Li C, Zou J, Zheng G, et al. MiR-30a Decreases Multidrug Resistance (MDR) of Gastric Cancer Cells[J]. Med Sci Monit,2016, 22：4509-4515.

[14] Tang QF, Sun J, Yu H, et al. The Zuo Jin Wan formula induces mitochondrial apoptosis of cisplatin-resistant gastric cancer cells via Cofilin-1[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2017, 2017(1)：8203189.

[15] 許春花, 楊磊, 湯旭蓁,等. 人源性胃癌移植瘤模型的初步建立及其評價[J]. 實驗動物與比較醫學, 2014, 34(4)： 259-265.

[16] 崔晉峰, 趙晨燕, 曹立勇,等. 食管胃交界腺癌和遠端胃癌KLF4SP1及CyclinD1表達的對比研究[J]. 中國腫瘤臨床,2014, 41(2)：108-112.

[17] 李平. 淺談胃癌的中醫藥治療[J]. 中醫藥臨床雜志, 2011,23(3)：207-208.

[18] Terashima M, Irinoda T, Fujiwara H, et al. Roles of thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase in tumor progression and sensitivity to 5-fluorouracil in human gastric cancer[J]. Anticancer Res, 2002, 22(2A)：761-768.

[19] Qin B, Tanaka R, Shibata Y, et al. In-vitro schedule-dependent interaction between oxaliplatin and 5-fluorouracil in human gastric cancer cell lines[J]. Anticancer Drugs, 2006,17(4)：445-453.

[20] Zhang X Q, Zhang H M, Sun X E, et al. Inhibitory effects and mechanism of 5-fluorouracil combined with celecoxib on human gastric cancer xenografts in nude mice[J]. Exp Ther Med, 2015, 9(1)：105-111.

[21] Chabner BA. NCI-60 Cell Line Screening： A Radical Departure in its Time[J]. J Natl Cancer Inst, 2016, 108(5).

Establishment and Characterization of Patient Derived Gastric Cancer Cell Lines

GE Xiao-mei1,2, ZHANG Yi-xin3, XIE Fu-bo1,4, LIU Ji-bin3, YANG Lei3, QU Ying-ying1,GU Ying1,5, Li Xue-ting1, YANG Wei-min1, LIU Xi-peng2, ZHOU He1,4,5, QIANG Fu-lin3
(1. Shanghai ChemPartner Co., Ltd, Shanghai 201203, China;2. Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;3. Nantong Tumor Hospital, Nantong 226361, China;4. Engineering Research Center for Pharmaceutical Translation, Shanghai 201203, China;5. Clinical Explorer (Shanghai) Co., Ltd, Shanghai 201203, China)

Objective To establish and characterize primary gastric cancer cell lines derived from gastric cancer patient-derived xenograft (PDX) models. Methods Tumors from 12 stable gastric cancer PDX models were selected to establish primary tumor cell lines when the tumor volume reached 500～900 mm3. The established cell lines were characterized by cell morphology, chromosome, STR and immunohistochemical analyses, in vivo tumorigenicity, as well as drug sensitivity in vitro and in vivo.Results Six primary gastric tumor cell lines were successfully established. GAXC031 and GAXC066 were selected and characterized thoroughly. STR analysis confirmed that these 2 cell lines were consistent with their parental PDX models. These 2 cell lines presented the morphological, histological and genomic characteristics of malignant gastric cancer cells. They generated xenograft readily in nude mice and these tumors maintained histology characteristics of the parental PDX tumors. Moreover, compared to the parental PDX models, these 2 cell lines initiated xenografts with higher take rate, shorter incubation period, and better uniformity in tumor growth. In vitro and in vivo drug sensitivity test showed that GAXC031 was more sensitive to 5-fluorouracil than that of GAXC066, while both cell lines were sensitive to cisplatin. Conclusions Six patient derived gastric cell lines were successfully established from PDX models in this study. Deep characterization showed that these cell lines maintained many characteristics of the original PDX models with improved take rate, latent period and uniformity,therefore represent useful tools in basic research and drug screening.

Patient-derived xenograft (PDX); Gastric cancer; Cell lines; Biological characteristics;Drug efficacy study

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0257-09

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.001

2017-01-25

科技部國家科技支撐計劃項目(2015BAH24F00)

葛曉梅(1989-), 女, 碩士, 研究方向： 腫瘤藥理。

E-mail： xmge@chempartner.cn

共同第一作者： 張一心(1956-), 男, 博士, 研究方向： 腫瘤學。E-mail： drzhangyx@163.com

周 禾, 女, E-mail： zhhe@chempartner.cn

共同通訊作者： 強福林, 男。E-mail： tian2008@163.com