3D 打印多孔鈦材料修復兔股骨髁骨缺損的實驗研究

鄧 威, 鄭 欣, 諶業帥, 芮 敏, 王 帆, 李 賽, 郭吉強, 劉 洪, 郭開今

(徐州醫科大學附屬醫院骨科, 徐州 221000; 2. 徐州市第一人民醫院影像科, 徐州 221000)

3D 打印多孔鈦材料修復兔股骨髁骨缺損的實驗研究

鄧 威1, 鄭 欣1, 諶業帥1, 芮 敏1, 王 帆2, 李 賽2, 郭吉強1, 劉 洪2, 郭開今1

(徐州醫科大學附屬醫院骨科, 徐州 221000; 2. 徐州市第一人民醫院影像科, 徐州 221000)

目的 研究3D打印的多孔鈦材料對骨缺損的修復能力和成骨性能。方法 選取20只6月齡新西蘭白兔, 在其股骨髁上制備直徑6 mm, 深10 mm的臨界性骨缺損。實驗組將多孔鈦材料迅速注入骨缺損區。對側生理鹽水沖洗, 不植任何材料, 作為對照組。術后3 d、4周、8周、12周通過X線及CT觀察骨缺損處生長變化，術后12周處死所有新西蘭白兔，通過大體觀察、X線、CT、Micro-CT及組織學觀察骨缺損處的修復情況。結果 實驗組與對照組一般情況良好，術后12周取出標本清理周圍軟組織，實驗組缺損部位被新生骨填充; 對照組見缺損處骨質凹陷; 影像學觀察，實驗組植入物區域與周圍界限模糊不清; 對照組未見明顯新生骨陰影; Micro-CT觀察，術后12周實驗組植入物區域空隙內長入新生骨組織，植入物附近可見骨小梁長入; 對照組缺損區未見明顯的骨長入; 硬組織切片觀察，實驗組植入材料與成骨細胞結合，可見成熟的哈佛氏系統散在分布于新生骨內; 對照組骨缺損區被大量纖維組織填充。IPP5.1計算新生骨與缺損區面積比，差異有統計學意義。結論 多孔鈦材料可以促進骨組織的生長愈合，新生骨組織可以長入并充滿孔隙，是一種很有應用前景的組織工程修復材料。

兔; 股骨髁; 骨缺損; 多孔鈦; 3D 打印

由高能創傷、感染、骨腫瘤或先天性畸形切除引起的大段骨缺損, 至今仍是骨科臨床醫生面臨的難題之一[1]。目前較為常用方法有自體骨移植或同種異體骨移植, 但這兩種方法都存在一定局限性[2]。自體骨移植需要增加額外的手術，創傷大，取骨處往往會伴有神經損傷、骨折、感染等相關并發癥[3]; 同種異體骨移植有誘發免疫反應、與宿主骨整合、重塑緩慢、傳播疾病等風險[4]。多孔鈦支架材料因其多孔結構與自然骨相接近，利于新生骨組織的長入而成為潛在的骨替代材料，為治療骨缺損提供了一種新的方式[5]。作者利用激光立體成形技術對鈦粉進行加工，制備出多孔鈦材料，采用動物實驗的方法，驗證該材料修復兔股骨髁骨缺損的能力，為下一步臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及相關儀器

選取6月齡普通級新西蘭白兔20只，雌雄不限，體質量為2.8～3.2 kg，由徐州醫科大學實驗動物中心提供[SCXK(蘇)2014-0009]。實驗過程中對動物的處置參照科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。多孔鈦材料(創生醫療器械有限公司,中國); 手術器械，電鉆及帶刻度6 mm關節鏡鉆頭(Smith & Nephew公司, 美國); DR設備(Philips公司,荷蘭); CT(Siemens公司, 德國); 光學顯微鏡(Olympus公司, 日本); Micro-CT(SkyScan1176公司，美國);硬組織切片機(EXAKT公司, 德國)。

1.2 實驗操作

多孔鈦材料經高壓蒸汽滅菌備用。以氯胺酮加氟哌利多肌肉注射麻醉，地西泮耳緣靜脈注射維持麻醉效果，麻醉生效后將兔仰臥位固定于動物實驗臺上，經過消毒鋪巾，在股骨外髁中點處做長約2 cm的縱形切口，依次切開并分離皮膚、皮下組織、肌肉及骨膜，暴露股骨外側髁。用帶刻度直徑6 mm關節鏡鉆頭在股骨髁中心距遠端關節面4 mm處鉆出直徑6 mm、深10 mm的骨缺損空腔(圖1)。隨機選擇一側股骨外髁，植入多孔鈦材料，對側股骨外髁缺損不植任何材料，生理鹽水沖洗，作為對照組。逐層關閉切口，傷口輔料包扎。術后所有兔單籠飼養，連續3 d給予青霉素80萬U肌肉注射。

1.3 觀測指標

1.3.1 大體觀察 觀察術前及術后兔的飲食、活動、傷口愈合情況。術后12周處死實驗動物, 取出標本, 觀察植入材料有無漏出, 盡量多地去除周圍軟組織，肉眼大體觀察骨缺損區的修復及植入材料有無降解及多孔鈦材料與宿主骨之間的愈合情況。1.3.2 影像學觀察 X線觀察術前兔股骨髁有無畸形并與術后對照，術后3d、4周、8周、12周觀察骨缺損植入材料有無移位、脫出，以及愈合和修復的情況。并做常規CT，三維重建及最大骨密度成像(MIP)。

圖1 實驗兔股骨髁缺損造模

1.3.3 Micro-CT觀察 術后12周選用SkyScan1176 Micro-CT，空間分辨率： 9 μm，18 μm; X-射線源：密封X-射線電子管 20～90 kV; 光斑尺寸： ＜5 μm; 功率： 25 W; 樣品掃描尺寸：在最高分辨率的情況下, 直徑為68 mm，最大掃描長度為200mm; 用Overlay疊加的方法通過不同顏色復合顯示各個標本植入物區域內的新生骨。

1.3.4 組織學觀察 制作股骨髁硬組織切片, HE染色, 光學顯微鏡下觀察新骨形成情況進行形態學分析,并應用IPP5.1圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)計算出新骨生成面積百分比(新生骨面積/骨缺損面積×100%)。1.4 統計學處理

應用SPSS19.0統計學軟件，實驗數據計量資料用x-± s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

植入材料后兔的一般情況良好，術后手術側兔下肢有不同程度腫脹，術后5 d時腫脹消失，切口愈合良好，無感染跡象，實驗過程中無兔死亡，活動及進食正常。術后12周處死實驗兔，取出標本清理周圍軟組織，可見實驗側骨缺損部位被新生骨組織填充，新生骨覆蓋材料，骨缺損邊界模糊不清，與周圍骨組織無明顯差別；對照組仍可見骨缺損處仍較周圍骨質略凹陷，被纖維包膜覆蓋，未修復(圖2)。

2.2 X線及CT觀察

2.2.1 X線觀察 術后3 d，術后4周、8周兩組于骨缺損處及周圍有不同程度的骨膜反應，均見少量骨痂形成。術后12周2組均見骨痂形成，實驗組骨缺損植入物區域密度較宿主骨高，骨痂形成較多，與周圍骨之間的界限模糊不清，材料表面的腔隙已被充填。對照組骨缺損區域密度較低，與周圍骨界限清晰可見，缺損區呈完全低密度透光影，可見低密度缺損區及點狀新生骨陰影(圖3)。

2.2.2 CT觀察 術后3 d，通過CT三維成像及最大密度投影(MIP)技術，可見骨缺損，植入物位置良好，排列整齊; 術后4周，可見骨缺損區域有纖維組織長入; 術后8周兩組標本均可見不同程度的骨膜反應在骨缺損區及植入材料周圍，并可見少量骨痂形成; 到術后12周，取出標本行CT檢查。兩組均見骨痂形成，實驗組多孔鈦植入區域密度較周圍宿主骨高并骨痂形成較多，并與周圍骨之間的界限模糊不清，多孔區域已被充填。對照組骨缺損區域密度較低，與周圍骨界限清晰可見，缺損區呈完全低密度透光影，可見低密度缺損區及點狀新生骨陰影(圖4)。

2.3 Micro-CT

術后12周可見實驗組植入物區域空隙內長入新生骨組織，與周圍宿主骨連接處有成片或者成網狀骨小梁生長, 新生骨與多孔材料結合緊密(圖5)。

2.4 組織學觀察

圖2 兔股骨髁缺損標本

圖3 兔股骨髁缺損術后X線觀察

圖4 兔股骨髁缺損術后CT觀察

圖5 兔股骨髁缺損術后Micro-CT觀察

術后12周，實驗組植入材料與周圍骨組織緊密結合，未見明顯炎性細胞浸潤，無纖維組織間隔，植入材料區域無明顯的骨吸收及骨溶解，材料與成骨細胞結合，新的骨小梁結構形成并與多孔鈦緊密結合，可見成熟的哈弗氏系統散在分布于新生骨內，新生骨小梁結構通過多孔鈦周邊部向骨缺生骨與骨缺損面積比為0.1721±0.046 5; 對照組為0.0291±0.0421(P＜0.01)。損中心區長入，植入材料被新生骨包饒，多孔鈦材料空隙內均可見新生骨長入; 對照組在骨缺損區邊緣可見無序的新生骨形成，數量較少，骨缺損區被大量的纖維組織填充(圖6)。

實驗組和對照組各選取5個切片, 通過IPP5.1圖像分析軟件計算新骨生成面積百分比=新生骨面積/骨缺損面積×100%。實驗組和對照組在光學顯微鏡10×視野下隨機選取5個視野，計算出新

圖6 兔股骨髁組織切片觀察

3 討論

骨缺損是嚴重危害人類健康的常見骨科疾病，造成骨缺損的原因很多，創傷、感染、腫瘤切除等較為常見，由于骨質的缺失，骨組織無法修復再生。骨缺損的治療是骨科最為困難的部分之一，目前主要為植骨，包括自體植骨或同種異體骨移植為主，且自體骨移植被公認為骨缺損修復的“金標準”。但采骨量有限，術后供區疼痛等制約了自體骨移植的應用，異體骨移植雖然克服了自體骨的一些缺點，卻有引發免疫排斥反應、傳播疾病的危險[6,7]。多孔材料利于成骨細胞和血管的長入和骨生成、骨誘導和骨傳導，而成為近年來研究的熱點[8]。近年來，新興的組織工程人工骨技術給骨缺損治療帶來了希望。

多孔鈦材料是一種優良的生物醫用材料，與人體骨骼密度和較為接近，具備良好的可加工性，以及很好地環境適應性[9]。表面多孔結構，有利于骨組織的長入，改善植入體和骨組織的相容性，同時能促進纖連蛋白和玻連蛋白在材料表面及內部的沉積[10]。

基于3D打印的多孔鈦材料因其多孔特性而成為骨替代物，其一，多孔結構利于成骨細胞的粘附、分化和生長，新生骨組織長入孔隙，加強了多孔鈦材料與宿主骨的連接，達到生物固定的作用；其二，多孔鈦的密度、強度和彈性模量能通過改變其孔隙度來調整，進而到達與宿主骨相匹配的力學相容性，避免植入體內發生骨變形、壞死和發生新骨畸變等；另外，開放的多孔結構利于血液和養料在植入物內的傳輸，促進組織的再生和重建，加快修復進程。有學者[11]研究表明，多孔材料相互連通的孔隙能給血管提供長入空間，為組織提供營養，促進新生骨的長入。

本實驗所采用的3D打印多孔鈦材料, 通過常規CT, Micro-CT觀察, 多孔鈦材料的外形符合骨缺損部位的大小和形態; 通過硬組織切片HE染色證實多孔鈦材料能很好的修復骨缺損區域。多孔鈦材料內部為相互連通的多孔開放系統，可以促進毛細血管向內生長, 提供細胞所需的充足的營養和氧分[12]。

有學者[13,14]認為 多孔鈦材料的孔徑150～600 μm都能讓骨組織長入。研究[15,16]表明，40%孔隙率連通性差的多孔鈦合金植入體內其鈣磷含量低于孔隙率70%為連通性好的植入體，間接表明了連通的孔隙結構對體液轉運的促進作用。本實驗所采用的多孔鈦材料的孔徑范圍是145～253 μm，空隙互相貫通，術后12周通過常規CT, Micro-CT, 硬組織切片組織學觀察，植入材料的孔隙內均已長入并充滿成熟的骨組織，骨缺損修復完整，植入物與周圍骨組織形成連續的骨性結合，說明本實驗所采用的多孔材料選擇恰當，適合成骨細胞長入，達到了骨缺損修復的實驗預期。

實驗表明, 多孔鈦材料表面及孔隙內大量新生骨組織生成及長入, 材料的多孔性更加利于成骨的早期貼附、增殖, 有利于骨缺損的修復。3D打印的多孔鈦材料在動物實驗中表現出良好的生物相容性,植入物周圍骨組織修復愈合良好, 植入物與骨界面形成骨結合, 新生骨組織長入并充滿材料的多孔結構。

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An Experimental Study on Repairing Femoral Condyle Defect by Printing Porous Titanium with 3D Technology in Rabbits

DENG Wei1, ZHENG Xin1, SHEN Ye-shuai1, RUI Min1, WANG Fan2,LI Sai2, GUO Ji-qiang1, LIU Hong2, GUO Kai-jin1
(1. Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, XuZhou 221000, China;2. Imaging Department of Xuzhou No.1 People’s Hospital, XuZhou 221000, China)

Objective To investigate the ability of the 3D printed porous titanium material for bone defect repairing and bone formation. Methods The critical bone defect models (6 mm in depth and 10 mm in diameter) were made of 20 six-month-old New Zealand white rabbits’ femoral condyle. One of the porous titanium material was swiftly implanted into the bone defect area (experimental group, n=20),with the opposite side as control group (also the blank group, n=20), washed with saline and sutured without any implants. The samples were harvested and observed by X-ray and CT examinations at 3 days and 4, 8, 12 weeks after the operation to assess bone growth in the bone defect area. At 12 weeks after the operation, all rabbits were euthanized and evaluate the bone defect repair through X-ray, CT,histology and Micro-CT. Results Both the experimental group and control group recovered with good condition. At 12 weeks after the operation, we can see that the bone defect area was filled with new bone in the experimental group after removing the soft tissue surrounding the bone defect area; In contrast,the bone defect in control group was seen hollow and covered with fibrous capsule. According to the radiological observation, the demarcation line between the defect area and the surrounding area was obscure in the experimental group; the bone defect area in control group saw an entire translucency with no obvious shadow reflecting the new-borne bone. The Micro-CT observations proved fresh bone tissue formed in the plantation area at 12 weeks after the operation, and the surrounding area could see bone trabecula grown, In comparison, there was no obvious bone formed in the defect area of control group,which was filled by fiber tissue and relatively less bone trabecula and new-borne bone tissue. The results of un-decalcificated bones slicing showed the implanted material appeared combined with osteoblast,and the mature harversian system was seen distributed within the new-borne bone; for control group, a small amount of unordered bone formed in the defect area, filled with a lot of fiber texture. The area ratio of new-borne bone and the defect area was calculated via the IPP5.1 software, producing differences that have statistical significance. Conclusion A series of experiments prove that the porous titanium material has high biosecurity and ability to promote bone growth and healing. The new-borne bone tissue can grow and fill the lacuna, thereby effectively repairing bone defect. In short, the 3D printed porous titanium is a kind of promising repairing material in the tissue engineering field.

Rabbits; Femoral condyle; Bone defect; Porous titanium; 3D printing

R683.4 Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0266-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.002

2017-02-23

江蘇省衛生計生委面上科研課題(H201528); 江蘇省級重點研發專項資金項目(BE2015627); 第59批中國博士后科學基金面上項目(2016M591929); 徐州市科技社會發展項目(KC15SH067)共同資助

鄧 威(1986-), 男, 醫學碩士, 研究方向： 運動創傷與關節鏡。E-mail：dengwei0223@163.com

郭開今, E-mail： xzgkj@sina.com