柘木提取物抗胃腸道腫瘤的免疫機制研究

謝家駿, 張國明, 喬正東, 陸宏祺, 嚴惠芳, 成 苗

(1. 上海中醫藥大學, 上海201203; 2.上海市中藥研究所, 上海201400; 3. 上海雷允上藥業有限公司,上海201400; 4. 上海市浦東醫院, 201399; 5. 上海醫藥工業研究院, 上海201203)

柘木提取物抗胃腸道腫瘤的免疫機制研究

謝家駿1, 張國明2,3, 喬正東4, 陸宏祺5, 嚴惠芳5, 成 苗2,3

(1. 上海中醫藥大學, 上海201203; 2.上海市中藥研究所, 上海201400; 3. 上海雷允上藥業有限公司,上海201400; 4. 上海市浦東醫院, 201399; 5. 上海醫藥工業研究院, 上海201203)

目的 觀測柘木提取物對正常或荷瘤動物免疫功能變化的影響，探討其抗癌作用機制。方法 給藥后觀察正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬細胞吞噬功能，檢測荷瘤小鼠淋巴細胞轉化和自然殺傷(NK)細胞毒活性。結果 柘木提取物對正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬細胞吞噬功能、對荷C26腸癌小鼠淋巴細胞轉化和NK細胞活性均有增強作用，最低有效劑量均為0.3 g/kg，相當于柘木生藥5.46 g/kg，為臨床單日使用劑量的1.3倍。結論 柘木提取物對胃腸道腫瘤抑制作用機制與其對胃腸道腫瘤細胞的直接抑制作用以及提高機體特異性和非特異性免疫功能有關。

柘木提取物; 胃腸道腫瘤; 抗腫瘤作用; 免疫功能

柘木為桑科柘屬植物柘樹[Maclura tricuspidata Carrière,Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur. ex Lavallee]去皮后的干燥根和藤莖[1]。柘木性溫味甘無毒, 具有清熱涼血、舒筋活絡的功效，近代民間有用其水煎液治療癌癥的報道[2]。20世紀中后葉, 柘木治療胃腸道腫瘤的藥品開發得到了廣泛關注[3-5]。在作者先期研究中顯示，柘木提取物對SGC-7901胃癌細胞和HCT-116腸癌細胞的生長均有抑制活性，對裸小鼠SGC-7901移植瘤和F1小鼠C26腸癌足趾重量均有減輕效果[6]。臨床應用也證實柘木制劑對胃腸道腫瘤患者化療或放療有輔助治療作用，并能改善病人的生活質量[7,8]。但有關柘木提取物治療胃腸道腫瘤的免疫機制卻少見有文獻報道，為此，本文通過選用正常及荷瘤動物免疫功能檢測方法對柘木提取物抑制胃腸道腫瘤的可能機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性F1 小鼠(BALB/c×ICR)，體質量18～20g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2002-0010]; 清潔級雄性ICR小鼠，體質量18～20 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2003-0002]。上述所有小鼠均分籠飼養(4～6只/籠)，飼以鼠用固體高壓料，試驗前禁食12h時，不禁水。

1.2 受試物

柘木提取物：柘木，切成小塊，加水7倍，提取4 h，收取藥液; 藥渣加水5倍，提取3h; 合并二次提取液后減壓濃縮至相對密度1.07(80 ℃)，經噴霧干燥而成干浸膏粉。該浸膏粉外觀性狀為黃棕色，味微苦、澀，每克浸膏粉相當于18.2 g生藥。該浸膏粉含總黃酮1.8%，山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖甙0.2%, 槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙0.18%，由上海市中藥研究所制備和提供，批號020708。實驗前，用蒸餾水配制成所需濃度的藥液備用。氟尿嘧啶針劑， 250 mg/10 mL，內容物為微黃色透明液體，上海旭東海普藥業有限公司產品，批號990632。使用時，用生理鹽水稀釋至10 mg/mL濃度備用。人參提取物：外觀性狀為淡黃色干浸膏粉，富含人參皂甙。使用時，用蒸餾水稀釋至800 mg/100 mL濃度的藥液備用。云芝糖肽膠囊：上海新康制藥廠產品，批號020707，實驗時，用蒸餾水稀釋至 0.08 g/mL濃度的藥液，備用。

1.3 腫瘤細胞株

小鼠 C26 腸癌和 L929 細胞株，由上海醫藥工業研究院藥理室提供。

1.4 儀器、試劑

8453紫外可見分光光度計(美國Agilent公司);310型CO2培養箱(美國Thermo 公司); 5804R冷凍離心機(德國Eppendorf公司); 2-16K離心機(德國Sigma公司)。

1.5 試驗方法

1.5.1 碳粒廓清試驗 小鼠48只，按體質量隨機分成4組，每組12只。受試物給藥組小鼠分別灌胃給柘木提取物0.3 g/kg、0.8 g/kg，陽性藥對照組灌胃給人參提取物0.16 g/kg，空白對照組灌胃給等容量蒸餾水。每日給藥1次，連續7d。給藥容量均為20 mL/kg。末次給藥后1 h, 分別在各小鼠尾靜脈處注入印度墨水0.1 mL/只, 于注射后l min及10 min, 先后自小鼠眼眶后靜脈叢取血20 μL，溶于2 mL 質量分數0.1%Na2CO3溶液中混勻，用紫外分光光度計，在680 nm波長處比色，讀取吸光度值(A)，并按以下公式計算吞噬指數X值和吞噬活性α值。

K=(LogA1-LogA10)÷(t10-t1)

α=K1/3×體質量÷(肝重+脾重)

其中A1和A10分別為注射印度墨水1 min和10 min時所取血樣的A, t10-t1為兩次取血樣的時間差。1.5.2 巨噬細胞吞噬試驗 小鼠60只，按體質量隨機分成4組，每組12只。受試物給藥組小鼠分別灌胃給柘木提取物0.3 g/kg、0.8 g/kg，陽性藥對照組灌胃給人參提取物0.16 g/kg，空白對照組給等容量蒸餾水，每日1次，連續7d。給藥容量均為20 mL/kg。末次給藥后每鼠腹腔注射體積分數2%雞紅細胞0.5 mL，1 h后頸椎脫臼法處死，剪開腹腔皮膚，腹腔內注入2 mL生理鹽水，輕揉小鼠腹部后，吸取腹腔沖洗液滴于載玻片上，于37 ℃溫育30 min，孵畢，于生理鹽水中漂去未被吞噬的雞紅細胞，吹干，1∶1丙酮-甲醇溶液固定5 min，4%Giemsa-Wright染色液染色3 min，晾干后于油鏡下觀察。計數100個巨噬細胞，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數。

吞噬百分率=100個巨噬細胞中吞噬有雞紅細胞的巨噬細胞數÷100個巨噬細胞數×100% ;

吞噬指數=100個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的總數÷100個巨噬細胞數

1.5.3 淋巴細胞增殖試驗 取 F1 小鼠，右足趾皮下接種無菌制備的 C26 腸癌混懸液 0.05 mL/鼠 (約1 × 106個腫瘤細胞)，次日隨機分成7組，每組8只。受試物不同劑量給藥組分別灌胃給柘木提取物0.3g/kg、0.6 g/kg、1.3 g/kg、2.6 g/kg、5.2 g/kg模型對照組灌胃給蒸餾水，陽性藥對照組灌胃給云芝糖肽膠囊藥液 2g/kg。每日 1 次，連續 10d給藥容量均為 20 mL/kg。末次給藥后次日在無菌條件下取小鼠脾臟，用 100 目篩網制成單個脾細胞懸液，用含 體積分數10% 滅活小牛血清的 RPM 1640 培養液調節細胞濃度為 1 × 107個細胞/毫升加入 96 孔細胞培養板，每孔 100 μL (1×106個細胞 /孔)，再加入含 ConA(5 μg/mL)培養液 100 μL置37 ℃體積分數5%CO2條件培養72 h。輕輕吸棄上清液100 μL，加入噻唑藍(MTT)溶液(MTT 5 mg/mL)20 μL。放置 37 ℃ 體積分數 5% CO2條件培養2 h后加入消化液100 μL，再放置至次日測各孔A值。實驗重復2次。刺激指數計算公式： 刺激指數 = 實驗組A值/對照組 A 值

1.5.4 自然殺傷(NK) 細胞毒活性檢測 取 F1 小鼠右足趾皮下接種無菌制備的 C26 腸癌混懸液0.05 mL鼠 (約 1 × 106個腫瘤細胞), 次日隨機分成7組, 每組8只。受試物不同劑量給藥組5組, 分別灌胃給柘木提取物 0.3 g/kg、0.6 g/kg、1.3 g/kg、2.6 g/kg 5.2 g/kg, 模型對照組灌胃給蒸餾水, 陽性藥對照組灌胃給云芝糖肽膠囊藥液 2 g/kg。每日1次，連續 10 d。給藥容量均為 20 mL/kg。末次給藥后次日在無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網制成單個脾細胞懸液, 低滲除去紅細胞, 將細胞懸液轉入培養瓶中, 37 ℃ 體積分數5% CO2條件培養 1 h后去除貼壁細胞，計數活細胞并調整細胞濃度為 3 × 10個細胞/毫升作為效應細胞。靶細胞取 L929 體外培養細胞，常規培養 24 h，以培養液調整細胞濃度為 1.5 × 105個細胞/mL，使效靶細胞之比為20∶1。取 96 孔培養板分別加入效應細胞和靶細胞, 另設效應細胞和靶細胞對照, 于 37 ℃體積分數5% CO2條件培養 4 h后，加入 MTT 染色液，再培養 2 h后加入消化液，于次日測各孔A 值。實驗重復2次。NK 細胞毒活性計算公式：

NK細胞毒活性(%)=[1-(實驗組A平均值-效應細胞A平均值)/ 靶細胞對照組A平均值]×100%

1.5.5 數據統計 采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計。計量資料采用± s表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時用LSD及SNK方法分析，方差不齊時用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 碳粒廓清試驗

柘木提取物使小鼠吞噬指數K值和校正吞噬活性α值均有升高，與空白對照組比較差異顯著(P＜0.05)(表 1)。

表 1 柘木提取物對正常小鼠碳粒廓清能力的影響Table 1 Effects of ZHEMU extrac on the ink clearance abilities in normal mice

2.2 巨噬細胞吞噬試驗

柘木提取物使小鼠對雞紅細胞的吞噬百分率或吞噬指數均有明顯提高(P＜0.05或 P＜0.01)(表2)。

表 2 柘木提取物對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Table 2 Effects of ZHEMU extrac on the phagocytosis of peritoneal macrophages in normal mice

2.3 淋巴細胞增殖試驗

柘木提取物對C26荷瘤小鼠的淋巴細胞轉化活性均有非常顯著的提高作用(P＜0.01)。受試物各劑量(由低劑量至高劑量)淋巴細胞轉化活性刺激指數分別為 1.37、1.45、1.38、1.35、1.39(表 3)。

2.4 NK 細胞毒活性檢測

柘木提取物對C26荷瘤小鼠的NK細胞毒活性均有非常顯著提高作用(P＜0.01)(表4)。

表 3 柘木提取物對C26荷瘤小鼠淋巴細胞增殖活性的影響Table 3 Effects of ZHEMU extrac on T Lymphocytes proliferative activity in C26 tumor bearing mice

表 4 柘木提取物對C26荷瘤小鼠NK細胞毒活性的影響Table 4 Effects of ZHEMU extrac on the cytotoxicity of NK cell in C26 tumor bearing mice

3 討論

柘木提取物(水煎劑)治療胃腸道腫瘤始于民間，以柘木提取物作為藥用原料進行抗癌藥物開發始于1960年代。經上海中藥制藥二廠、上海市第九制藥廠、上海市醫藥工業研究院、河南醫學學科研究所、上海市中藥研究所以及上海雷允上藥業有限公司的歷代科研人員的不懈努力，柘木糖漿[4]產品于1977年被批準上市，柘木注射劑在1980年研發成功，柘木顆粒[5]于2008年獲得生產批件。

40多年來，以柘木提取物作為藥用原料的制劑在臨床上得到廣泛應用[9,10]。臨床結果顯示，柘木制劑對胃腸道腫瘤具有明顯抑制療效。前期主要藥效學研究結果亦顯示，柘木提取物體外對SGC-7901胃癌細胞和HCT-116腸癌細胞生長有直接抑制活性，灌胃給藥對裸小鼠SGC-7901移植瘤和F1小鼠C26腸癌足趾重量有明顯減輕效果[6]。藥效和臨床結果均顯示，柘木提取物對消化道腫瘤具有明顯抑制作用。

柘木提取物對胃腸道腫瘤患者化療或放療呈現良好輔助治療作用已成為其臨床應用的一大特點，表現為能改善患者臨床征候，保護細胞免疫功能，改善病人生活質量，且未見明顯不良反應[7]。對此，本文就柘木提取物對機體免疫調節作用進行了探索，結果表明其能顯著提高正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬細胞吞噬功能，明顯增強對荷瘤小鼠淋巴細胞轉化和NK細胞毒的活性。該結果提示，柘木提取物對胃腸道腫瘤的抑制作用與其通過免疫系統直接或間接增強機體抗腫瘤效應有關。關于柘木提取物對正常和荷瘤動物的淋巴細胞轉化試驗及各種細胞因子測定等有待進一步研究。

據成分分析，本受試物柘木提取物中富含黃酮和多糖類化合物。有研究認為，柘木中的黃酮類化合物是抗癌、抑癌的有效成分[10-14]，多糖類化合物參與了機體的免疫調節[15,16]，兩者對胃腸道腫瘤具有協同對抗作用。柘木提取物抑制胃腸道腫瘤的多靶點效應，其所富含的黃酮和多糖類化合物可能就是其藥效活性物質基礎。

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Immunologic Mechanism of Inhibition on Gastrointestinal Tract Tumors of ZHEMU Extract

XIE Jia-jun1, ZHANG Guo-ming2,3, QIAO Zheng-dong4, LU Hong-qi5, YAN Hui-fang5, CHENG Mao2,3
(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;2. Shanghai Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai 201400, China;3. Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd,Shanghai 201400, China;
4. Shanghai Pudong Hospital, Shanghai 201399, China;5. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China)

Objective To observation the changes of immune function in normal or tumor bearing animal after dose ZHEMU extract. Methods The carbon particle clearance test, macrophage phagocytosis test. NK cells activity and lymphocyte transformation in tumor bear animal are detected. Results The carbon granula clearance ability and phagocytosis of macrophage cell in abdominal on normal mice, and the lymphocyte transformation and natural killer (NK) cell activity in tumor bearing mice were enhanced after dosing, and the lowest effective dose were 0.3 g/kg, equivalent to the crude herb 5.46 g/kg, which was 1.3 times of clinical daily dose. Conclusions ZHEMU extract can restrain the growth of gastrointestinal tract tumors, and its mechanism may be related to the direct inhibition of the gastrointestinal tract cancerous cells growth and the improvement of the body's specific and non-specific immune function.

ZHEMU extract; Gastrointestinal tract tumors; Anti-tumor activity; Immune function

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0278-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.004

2017-02-06

謝家駿(1959-), 男, 研究員, 研究方向： 主要從事中藥藥理毒理學研究與中藥新藥開發研究。E-mail： xiejj001@163.com