不完全睡眠剝奪對(duì)青春期SD大鼠生長發(fā)育的影響

朱寅秋, 汪雅荻, 嚴(yán)國鋒, 周 晶, 汪 靜, 袁聰俐, 馬政文

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海200240; 2. 上海盧灣中學(xué), 上海200025;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部, 上海200025）

不完全睡眠剝奪對(duì)青春期SD大鼠生長發(fā)育的影響

朱寅秋1,3, 汪雅荻2, 嚴(yán)國鋒3, 周 晶3, 汪 靜3, 袁聰俐1, 馬政文3

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海200240; 2. 上海盧灣中學(xué), 上海200025;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部, 上海200025）

目的 觀察不完全睡眠剝奪對(duì)青春期大鼠生長發(fā)育的影響，從而為充足睡眠對(duì)青少年生長發(fā)育的重要性提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。方法 4周齡SD大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為正常對(duì)照組和三個(gè)睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)組(睡眠9 h、睡眠6 h、睡眠3 h)。采用“小平臺(tái)水環(huán)境”方法建立睡眠剝奪模型，觀察SD大鼠在整個(gè)青春發(fā)育期(4～8周齡)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠間體質(zhì)量、體長、行為習(xí)慣及大腦海馬發(fā)育情況等方面的變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量、體長增長減緩(P＜0.01); 行為躁狂易激惹、精神狀態(tài)差甚至出現(xiàn)死亡; 性腺周圍脂肪明顯減少，性激素分泌減少。結(jié)論 長期不完全睡眠剝奪可能造成青春期SD大鼠發(fā)育遲緩。

睡眠剝奪; 青春期; 大鼠; 生長發(fā)育; 性激素

睡眠剝奪(睡眠缺失/不足, sleep deprivation)即睡眠時(shí)間至正常生理需要量以下。研究表明, 睡眠不足的人常伴有情緒異常、感知和學(xué)習(xí)記憶能力降低, 而青少年睡眠不足會(huì)影響身體和智力發(fā)育[1-5]。

有關(guān)睡眠對(duì)兒童生長發(fā)育影響的研究[6]，缺乏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。長期不完全睡眠剝奪，接近于現(xiàn)實(shí)生活中的睡眠缺失情況。本課題模擬青少年長期不完全睡眠不足, 對(duì)4周齡青春期SD大鼠按組別每日給予不同時(shí)間的睡眠剝奪，連續(xù)4周。采用“小平臺(tái)水環(huán)境”方法建立長期不完全睡眠剝奪模型，觀測睡眠剝奪對(duì)大鼠在整個(gè)青春發(fā)育期(4～8周齡)的體質(zhì)量、體長、行為習(xí)慣、性激素水平、性腺周圍脂肪重量、性腺發(fā)育及大腦海馬的影響，以期為青少年充足睡眠對(duì)生長發(fā)育的重要性提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡清潔級(jí)SD大鼠40只, 雌雄各半, 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK(滬)2012-0002)飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院[SYXK(滬)2013-0050]

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

1.2.1 自制睡眠剝奪水臺(tái)裝置 用透明有機(jī)玻璃粘合，搭建60 cm×60 cm×30 cm的全包圍有機(jī)玻璃盒子，盒子內(nèi)用有機(jī)玻璃搭建9個(gè)高度5 cm頂部直徑5 cm的圓柱形水臺(tái)，該水臺(tái)大小以只允許一只大鼠站立其上為準(zhǔn)。通常裝置內(nèi)水面高度離水臺(tái)1 cm左右。有機(jī)玻璃盒子上配有多個(gè)通氣孔、透明有機(jī)玻璃上蓋，以保持空氣暢通，同時(shí)防止大鼠逃逸。

1.2.2 儀器、設(shè)備與試劑 稱量天平(YB601N 上海海康電子儀器廠)、Thermo離心機(jī)(Legend micr 017)化學(xué)發(fā)光免疫測定儀(雅培, 美國Architect i2000)石蠟切片機(jī)(德國、Leica2235)。氯胺酮(福建古田藥業(yè)，批號(hào)： 1507294)。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 40只大鼠隨機(jī)分為4組： 睡眠3 h(睡眠剝奪8 h)組、睡眠6 h(睡眠剝奪5 h)、睡眠9 h(睡眠剝奪2 h)組和正常對(duì)照組。自然狀態(tài)下，4周齡大鼠的睡眠時(shí)間約為11 h/24 h。

1.3.2 大鼠睡眠剝奪模型建立 采用“小平臺(tái)水環(huán)境法”, 4周齡大鼠實(shí)驗(yàn)組按組別每日分別在特殊水臺(tái)上放置21 h(睡眠3 h組)、18 h(睡眠6 h組)和15 h(睡眠9 h組), 大鼠限制于水臺(tái)上, 一旦瞌睡就會(huì)跌入水中, 強(qiáng)迫其清醒復(fù)位, 從而建立睡眠剝奪模型。睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)實(shí)施至大鼠8周齡(性成熟), 為期4周。1.3.3 大鼠行為學(xué)觀察 每日觀察大鼠進(jìn)食、被毛光澤、行為、習(xí)慣、精神狀態(tài)變化。

1.3.4 大鼠生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)觀察 每2周檢測一次，用稱量天平稱量大鼠的體質(zhì)量; 用標(biāo)準(zhǔn)皮尺測量仰臥位大鼠從鼻尖到尾尖的距離為體長; 大鼠經(jīng)麻醉(100 mg/kg 體質(zhì)量)后, 心臟采血, 3 000 r/min離心15 min, 分離血清，用化學(xué)發(fā)光免疫測定儀檢測孕酮、睪酮、雌二醇、催乳素水平。心臟采血后自由休息24 h，停止睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)，使大鼠恢復(fù)。

1.3.5 大鼠性成熟后卵巢觀察 至大鼠8周齡，取性腺周圍脂肪稱重，比較正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的區(qū)別。取雌性大鼠卵巢，直接浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，4～5 d后梯度乙醇脫水、石蠟包埋,切片后蘇木素-伊紅染色(HE染色), 觀察卵巢結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)用x-± s表示，采用Prism(4.5版本)軟件，用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行組間方差分析(Two-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立青春期SD大鼠睡眠剝奪模型

實(shí)驗(yàn)開始前(4周齡)心臟采血時(shí)有4只大鼠未能從麻醉中復(fù)蘇。進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)大鼠，對(duì)照組8只(雄性 =4, 雌性 =4), 9 h 組 9 只(雄性 =5, 雌性 =4)都經(jīng)歷4周睡眠剝奪, 沒有死亡; 6 h組、3 h組于實(shí)驗(yàn)開始后1周內(nèi)分別有1只和2只雄性大鼠死亡, 而在6周齡心臟采血后, 3 h組有一只雌性大鼠未能從麻醉中復(fù)蘇。因此, 6 h組有8只大鼠(雄性=4, 雌性=4)、3 h組有6只大鼠(雄性=3, 雌性=3)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。

2.2 發(fā)育期大鼠行為學(xué)觀察

對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組每日飼料消耗量, 雌性大鼠基本相同, 雄性大鼠中對(duì)照組略高于各實(shí)驗(yàn)組，尤其是6～8周齡, 而各實(shí)驗(yàn)組間同性別大鼠沒有差別。

對(duì)照組大鼠被毛光滑、性格溫順、狀態(tài)良好;9 h組與正常組差別不大; 6 h組大鼠毛發(fā)光澤度不夠，開蓋時(shí)偶有大鼠往外跳、試圖逃跑，實(shí)驗(yàn)開始一周內(nèi)1只雄性大鼠溺水; 3 h組大鼠毛發(fā)無光澤、個(gè)別被毛粗糙，眼球突出、狀態(tài)較差，開蓋時(shí)經(jīng)常有大鼠往外跳、試圖逃跑, 暴躁易激惹、狂躁尖叫、出現(xiàn)攻擊行為、捕捉不易，實(shí)驗(yàn)開始一周內(nèi)2只雄性大鼠溺水、1只雌鼠采血后死亡。

2.3 發(fā)育期大鼠生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)變化

2.3.1 體質(zhì)量變化 如表1所示, 實(shí)驗(yàn)初始各組大鼠體質(zhì)量相似。6周齡時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量增長均低于對(duì)照組(P＜0.01)，雌性大鼠9 h組明顯高于3 h組(P＜0.01); 雄性大鼠9 h組與6 h、3 h組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)。8周齡時(shí), 各實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量增長明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。雌、雄性大鼠3 h組均明顯低于9 h、6 h組(P＜0.01);9 h組與6 h組間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

2.3.2 體長變化 與體質(zhì)量變化趨勢基本一致，詳見表1。

2.3.3 發(fā)育期大鼠性激素變化 由表2可知，6周齡時(shí), 相同性別中對(duì)照組孕酮分泌明顯高于各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.001); 8周齡時(shí), 各組內(nèi)雄性與雌性大鼠的孕酮含量有顯著性差異(P＜0.001)。雌性大鼠9 h、6 h組及對(duì)照組的組內(nèi)8周齡與4周齡孕酮有顯著差異(P＜0.01);雄性對(duì)照組大鼠8周齡孕酮含量明顯低于6周齡(P＜0.05)。雌性大鼠睪酮8周齡時(shí)對(duì)照組與3 h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); 8周齡時(shí)雄性大鼠睪酮對(duì)照組與6 h、3 h組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05和P＜0.001),9 h組與3 h組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。對(duì)照組雌雄大鼠在8周齡與4周齡的睪酮有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05, P＜0.01)。6周齡時(shí), 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8周齡時(shí), 雌性大鼠雌二醇對(duì)照組與6 h組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); 相同周齡雌雄大鼠之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 相同性別各實(shí)驗(yàn)組間有顯著差異(P＜0.01)。各組雌雄大鼠血清中的催乳素含量在4到8周內(nèi)維持在相似水平, 且各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 SD大鼠性成熟后的性腺周圍脂肪、卵巢組織的觀察

2.4.1 性腺周圍脂肪變化 SD大鼠在8周齡時(shí)解

剖、分離性腺周圍包裹的脂肪，并稱重。正常組雌性大鼠卵巢周圍的脂肪重量幾乎是各實(shí)驗(yàn)組脂肪重量的10倍(P＜0.001), 而各實(shí)驗(yàn)組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組雄性大鼠睪丸周圍的脂肪重量是各實(shí)驗(yàn)組脂肪重量的3.36～6.85倍(P＜0.001), 9 h、6 h、3 h實(shí)驗(yàn)組性腺周圍脂肪的重量依次降低, 但組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 1 大鼠各階段體質(zhì)量及體長

表 2 大鼠各階段激素水平

2.4.2 卵巢發(fā)育 SD雌性大鼠8周齡時(shí), 正常對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的卵巢已基本發(fā)育成熟。卵巢外覆結(jié)締組織白膜。卵巢外周部的皮質(zhì)較厚, 含有發(fā)育不同階段、大小不一的卵泡(圖1，對(duì)照組： A-B; 6 h組： G-I)，可見卵泡腔較大的次級(jí)卵泡(*)，以及很大的黃體(圖1，A, D, G, J中標(biāo)記“L”)。中央部為髓質(zhì)(圖1，A中“#”標(biāo)記處)，結(jié)締組織較疏松，無卵泡, 含血管較多。初級(jí)卵泡發(fā)育成為次級(jí)卵泡，后者有一個(gè)更大的卵泡腔(圖1, C和I)，初級(jí)卵母細(xì)胞(圖1，C和I中“△”所指)位居卵泡一側(cè)并與周圍的卵泡細(xì)胞凸向卵泡腔，形成卵丘(圖1，C和I中“↑”所指)，卵泡腔周圍密集的卵泡細(xì)胞(又稱顆粒細(xì)胞)形成顆粒層(圖1, C和I中“▲”所指), 其外側(cè)為卵泡膜。卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞較多、胞質(zhì)染色淺, 稱膜細(xì)胞。卵泡發(fā)育中分泌的雌激素是由顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞協(xié)同作用生成的。

圖1 8周齡雌性SD大鼠卵巢結(jié)構(gòu)

圖1中E和K顯示輸卵管(¤)結(jié)構(gòu)。黏膜皺襞發(fā)達(dá), 皺襞高而分支多; 肌層薄, 外膜為疏松結(jié)締組織。

3 討論

了解睡眠剝奪對(duì)機(jī)體生長、發(fā)育造成的影響，并采取相應(yīng)措施減少睡眠剝奪將具有實(shí)際意義。

睡眠剝奪是一種經(jīng)典的內(nèi)源性應(yīng)激[7]，可激活人體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)，致機(jī)體內(nèi)分泌、免疫、泌尿生殖、神經(jīng)精神系統(tǒng)等功能紊亂，甚至導(dǎo)致死亡。本實(shí)驗(yàn)中4周齡SD大鼠開始睡眠剝奪后一周內(nèi)，6 h組和3 h組分別有1只雄性和2只雄性大鼠死亡，并隨著周齡增長，各實(shí)驗(yàn)組大鼠雖然狀態(tài)不好(睡眠越少，狀態(tài)越差)，但是再?zèng)]有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。提示年齡越小，睡眠剝奪后造成的影響越嚴(yán)重; 而雄性相對(duì)雌性更易受應(yīng)激，嚴(yán)重時(shí)或產(chǎn)生猝死現(xiàn)象。這與流行病學(xué)調(diào)查一致，睡眠時(shí)間的持續(xù)減少與人群猝死率的上升有關(guān)[7]。

各實(shí)驗(yàn)組大鼠在4周齡到8周齡發(fā)育過程中, 體質(zhì)量與體長的增長都較正常對(duì)照組滯緩, 隨著發(fā)育進(jìn)程, 這種差異越明顯; 而各實(shí)驗(yàn)組間也呈現(xiàn)差異, 睡眠時(shí)間越少, 增長越慢。青春期大鼠的體質(zhì)量、體長增長可能直接與睡眠時(shí)間有關(guān), 睡眠越少, 體質(zhì)量體長增長越慢。Cohen等[8]應(yīng)用平臺(tái)法剝奪大鼠睡眠實(shí)驗(yàn)中,也表明睡眠剝奪可引起動(dòng)物的體質(zhì)量減輕及胸腺重量減輕, 機(jī)體免疫反應(yīng)抑制等, 與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

正常組雌性大鼠孕酮分泌從4周齡開始持續(xù)上升，而各實(shí)驗(yàn)組則在6周齡時(shí)下降，然后再上升; 正常組及各實(shí)驗(yàn)組雌二醇分泌在6周齡時(shí)都較4周齡升高一倍，正常組與9 h組雌二醇分泌持續(xù)升高至8周齡，而6 h和3 h組雌二醇分泌則下降。提示剝奪青春期雌性大鼠睡眠可能使其發(fā)育延遲。正常組雄性大鼠睪酮分泌略有升高，8周齡時(shí)升高明顯，而各實(shí)驗(yàn)組有升高也有降低，9 h組與6 h組不如正常組睪酮含量高, 其中6 h組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而3 h組睪酮分泌則下降。提示剝奪青春期雄性大鼠睡眠可能使其發(fā)育滯后。孫清梅等[9]曾報(bào)道，對(duì)青春期Wistar大鼠(4～5周齡)進(jìn)行72 h睡眠剝奪，雌性大鼠雌二醇含量、雄性大鼠睪酮含量都較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果顯示短期、完全性睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致青春期大鼠性激素分泌減少。本文所用的不完全睡眠剝奪模型也顯示了長期反復(fù)睡眠剝奪可能會(huì)使大鼠性激素分泌減少、發(fā)育滯后。有報(bào)道[5]睡眠剝奪后, HPA軸過度激活, 負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，從而導(dǎo)致睡眠剝奪后性激素分泌減少，發(fā)育滯后。

性腺周圍脂肪屬于內(nèi)臟脂肪的一種，雌激素通過結(jié)合脂肪細(xì)胞上的雌激素受體而作用于脂肪細(xì)胞，因此，脂肪含量與雌激素水平有關(guān)。脂肪越多，雌激素水平越高，而脂肪中的芳香酶也會(huì)將雄激素(睪酮)轉(zhuǎn)化成雌激素。當(dāng)脂肪含量少時(shí)，雌激素水平也會(huì)降低。典型的雌性和雄性脂肪分布方式出現(xiàn)在青春期，與血液循環(huán)中性激素水平的升高相關(guān)[10]。而在本文實(shí)驗(yàn)中睡眠剝奪的發(fā)育期大鼠，其性腺周圍脂肪含量少，與對(duì)照組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。一方面反應(yīng)了其體內(nèi)脂肪少，另一方面青春期睡眠剝奪影響了性腺周圍脂肪的分布和含量，可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組雌激素含量減少的原因之一。盡管雌激素含量降低性腺周圍脂肪減少，但是各組8周齡時(shí)卵巢發(fā)育基本正常。提示睡眠剝奪對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的不良影響比對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的影響可能更大些。

綜上所述, 長期不完全睡眠剝奪(部分睡眠剝奪)會(huì)影響青春期大鼠生長、發(fā)育, 表現(xiàn)在體質(zhì)量、體長增長緩慢, 性激素分泌減少, 性腺周圍脂肪含量減少。因此, 睡眠剝奪對(duì)青春期身體影響是多方面的, 探究睡眠剝奪對(duì)身體影響機(jī)理, 對(duì)于尋求有效預(yù)防措施和干預(yù)手段、并指導(dǎo)青少年正確學(xué)習(xí)、睡眠具有重要意義

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Q95-33

B

1674-5817(2017)04-0295-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.008

2016-05-06

2017-03-31

國家自然基金青年基金81200940和2013閔行區(qū)產(chǎn)學(xué)研合作基金

朱寅秋(1986-), 男, 碩士研究生, 從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與獸醫(yī)研究。E-mail： zhuyq@shsmu.edu.cn

馬政文(1972-), 女, 博士, 副研究員, 從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與神經(jīng)生物學(xué)。E-mail： mazhengwen@shsmu.edu.cn袁聰俐(1981-), 男, 副研究員, 從事感染與免疫方面的研究。E-mail： yec@sjtu.edu.cn