綠色熒光裸小鼠動情周期的觀察

胡文娟, 方 天, 陳 莉, 劉 彪, 梁 磊, 許龍祥, 惲時峰

(南京軍區南京總醫院比較醫學科, 全軍實驗動物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地, 南京 210002)

綠色熒光裸小鼠動情周期的觀察

胡文娟, 方 天, 陳 莉, 劉 彪, 梁 磊, 許龍祥, 惲時峰

(南京軍區南京總醫院比較醫學科, 全軍實驗動物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地, 南京 210002)

目的 觀察綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)動情周期的變化。方法 采用陰道涂片法，連續15 d，分別對40只性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)進行陰道涂片觀察，計算規律動情周期發生率，記錄動情周期各階段陰道涂片特征及持續天數，作比較分析。 結果 綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的規律動情周期發生率分別為77.5%和82.5%，明顯低于BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的90%及95%; 綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情周期總持續時間為7～8 d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的持續時間為5～6 d (P＜0.05)，其中綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期、動情期、動情后期持續時間與普通BALB/c裸小鼠的持續時間相差較大(P＜0.05)。結論 通過陰道涂片法可以確認綠色熒光裸小鼠所處的動情周期階段，為后期在不同的動情周期內研究雌性綠色熒光小鼠生殖功能提供可靠的實驗數據，提高實驗操作的準確性。

綠色熒光; 動情周期; 陰道涂片; 生殖功能

綠色熒光蛋白(GFP)現已成為細胞生物學和分子生物學中應用最廣泛的分子標記之一。綠色熒光裸小鼠是將GFP基因導入BALB/c 裸小鼠而得來[1]。本科室自建立綠色熒光轉基因裸鼠以來，對該品系鼠進行了多項研究，測定了主要的生理生化指標及部分免疫學指標, 檢測了主要臟器質量和臟器系數,并研究了在主要組織中熒光蛋白的分布特點[2-5]。在日常繁育中，觀察到綠色熒光裸小鼠繁殖性能較為低下，對雄性綠色熒光裸小鼠研究顯示，該品系雄性小鼠精子質量低下可能導致了繁殖性能的下降[6]。作者推測GFP基因可能對雌性小鼠的生理功能也產生影響。因在實際生產操作中，大多采用雄性純合子(GFP nu/nu)與雌性雜合子(GFP nu/+)交配，故本實驗連續15 d對性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非 GFP nu/nu)及 BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)分別進行陰道涂片觀察，以確定雌性綠色熒光裸小鼠的規律動情周期[7](動情前期、動情期、動情后期、動情間期)發生率以及動情周期各階段的陰道涂片特征及持續天數，為后期在不同動情周期內研究GFP是否對綠色熒光裸小鼠生殖功能產生影響，提高實驗操作的準確性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、器材與試劑

分別取未生育的8～10周齡SPF級雌性綠色熒光裸小鼠(GFP nu/nu)、綠色熒光雜合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c雜合小鼠(非GFP nu/+)各40只，綠色熒光裸小鼠及雜合子為本科室提供[SCXK(軍)2012-0014]，BALB/c裸小鼠及雜合子購于常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2011-0003]。四組動物均在SPF級設施飼養[SYXK(軍）2012-0047]。光學顯微鏡、載玻片、醫用棉簽、生理鹽水。

1.2 方法

將40只雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠分別編號，于每日清晨8∶00～8∶30檢測小鼠動情周期。用左手食指和拇指捏住小鼠尾，余下三指輕輕按壓小鼠后腰背部，將其固定在操作臺上，翻起尾暴露陰道口，用浸潤了生理鹽水的醫用消毒棉簽緩緩插入小鼠陰道內0.5～1 cm，轉動2～3周，蘸取脫落細胞，并將其均勻涂在載玻片上[8]。對涂片采用美蘭染色，于光學顯微鏡下觀察陰道脫落細胞，記錄小鼠動情周期變化情況。

根據文獻[9]方法判斷動情周期各個階段：動情前期陰道脫落細胞以體積較大的有核上皮細胞為主；動情期陰道涂片多為無核的角化上皮細胞，像落葉一樣堆積在一起; 動情后期兼有白細胞，有核上皮細胞與無核角化細胞，三種細胞數量無明顯差別; 動情間期以白細胞為主。

1.3 統計學處理

記錄實驗數據，計算規律動情周期發生率(%)=(發生規律動情周期的小鼠數/總實驗小鼠數)×100%[10]; 采用SPSS 軟件對記錄的動情周期變化維持時間進行統計學處理，數據以x-± s表示, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 規律動情周期發生率

實驗表明，31只綠色熒光裸小鼠出現規律的動情周期，9只并未出現動情周期或動情周期極為不規律，即綠色熒光裸小鼠的規律動情周期發生率為77.5%(31/40)。綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的規律動情周期發生率分別為 82.5%(33/40)、90.0%(36/40)和 95.0%(38/40)

2.2 動情周期脫落細胞觀察

鏡下觀察顯示，綠色熒光裸小鼠的動情周期脫落細胞情況與其他幾組小鼠并無明顯差異，故只附上綠色熒光裸小鼠的鏡下照片以供觀察。動情前期： 陰道分泌物中大多為膨大的有核上皮細胞，呈橢圓形，白細胞較少(圖1A); 動情期： 多為無核的角化上皮細胞，外形不規則，成堆聚集在一起呈落葉狀(圖1B); 動情后期： 白細胞開始增多，有核上皮細胞及無核角化上皮細胞均可見(圖1C); 動情間期： 以白細胞為主，偶見一些有核上皮細胞細胞總數較少(圖1D)。

2.3 動情周期各階段

綠色熒光裸小鼠動情周期持續時間為(186.27±22.72) h, 其余3組小鼠的持續時間分別為(184.49±14.12) h、(131.12±18.87) h(P＜0.05)和(133.95±20.04) h(P＜0.05)。四組小鼠各階段所占時間見表1綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期動情期和動情后期持續時間與BALB/c裸小鼠存在明顯差異(P＜0.05); BALB/c雜合小鼠與BALB/c裸小鼠在動情周期中并無統計學差異。

3 討論

表 1 四組小鼠動情周期各階段持續時間 h

研究GFP基因對小鼠生殖功能的影響，了解動情周期是個關鍵問題之一。因此，確定雌性綠色熒光小鼠所處動情周期的階段及各階段所持續的時間，可提高后期實驗的準確性，使研究更為科學可靠。陰道涂片法是目前常用的動情周期判定方法之一，常見的3種細胞分別為角化上皮細胞、有核上皮細胞以及白細胞，細胞形態易區分[11]，所以采用此法判斷動情周期簡易實用。

本實驗連續15 d分別對40只性成熟期未生育的雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠分別進行陰道涂片觀察, 結果顯示, 雌性綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的規律動情周期的發生率分別為77.5%和82.5%，明顯低于對BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的規律動情周期發生率(90.0%和95.0%)。出現規律動情周期的綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠，其動情周期總持續時間為7～8d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c雜合小鼠的持續時間為5～6 d (P＜0.05), 其中綠色熒光裸小鼠及綠色熒光雜合小鼠的動情前期、動情期、動情后期持續時間與普通BALB/c裸小鼠的持續時間相差較大(P＜0.05)，而動情間期持續時間無明顯差異。本文綠色熒光裸小鼠的動情周期與李娟等[12]對BALB/c小鼠動情周期觀察結果比較也存在較為明顯差異。

圖1 綠色熒光小鼠陰道涂片脫落細胞

研究表明[13]，在動情間期，雌激素含量低，孕酮含量高; 在動情前期，雌激素分泌開始增加，但是對陰道上皮的刺激作用仍然很低; 動情期，雌激素水平達到闕值; 動情后期是動情期向動情間期的過渡。雌性小鼠生殖周期的變化主要通過丘腦下部、垂體前葉和卵巢分泌的激素進行調節。通過陰道脫落細胞涂片法觀察動物動情周期的變化能夠合理地反映卵巢活性及其分泌性激素的能力。動情周期的紊亂是反應性激素代謝失調的敏感指標[14]。GFP基因可能對小鼠的激素調控基因表達方面造成影響，從而改變了雌性綠色熒光裸小鼠的激素水平，使激素代謝失調可能導致動情周期的變化，為確認此推測，后續將進一步研究雌性綠色熒光裸小鼠的生殖功能，包括臟器系數、激素水平等。

本實驗通過陰道涂片法對雌性綠色熒光裸小鼠、綠色熒光雜合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c雜合小鼠的規律動情周期發生率以及動情周期各階段的陰道涂片特征及持續天數進行了觀察，為后期在不同的動情周期內研究雌性綠色熒光裸小鼠生殖功能提供可靠的實驗數據，提高實驗操作的準確性; 進一步找出綠色熒光裸小鼠繁殖性能下降的原因，也有助于將綠色熒光裸小鼠更好、更為廣泛地運用于科學實驗。

[1] 張立波, 劉彪, 田小蕓, 等. 綠色熒光裸小鼠的選育初報[J].實驗動物與比較醫學, 2013, 33(4)：306-309.

[2] 尤金煒, 張立波, 方天, 等. 綠色熒光裸鼠血液生理生化指標檢測分析[J]. 中國比較醫學雜志, 2013, 23(9)：23-26.

[3] 尤金煒, 董敏, 劉彪, 等. GFP在綠色熒光裸鼠不同組織中的表達及分析[J]. 中國實驗動物學報, 2014, 22(5)：67-70.[4] 方天, 尤金煒, 張立波, 等. GFP轉基因裸鼠脾臟組織學觀察[J]. 中國比較醫學雜志, 2012, 22(11)：6-9.

[5] 尤金煒, 劉彪, 張旭亮, 等. 綠色熒光裸鼠部分免疫學指標的測定及分析[J]. 實驗動物科學, 2015, 32(5)：15-17.

[6] 胡文娟, 方天, 劉彪, 等. 綠色熒光裸小鼠睪丸組織學觀察及精子質量檢查[J]. 實驗動物與比較醫學, 2016, 36(2)：126-128.

[7] 魏泓. 醫學實驗動物學[M]. 成都： 四川科學技術出版社,1998：164-165.

[8] 劉曉宇, 王嬌, 錢欣, 等. 圍絕經期大鼠動情周期的變化研究[J]. 哈爾濱醫科大學學報, 2014, 48(5)：358-360.

[9] 何秋明, 肖尚杰, 夏慧敏. 大鼠陰道涂片的觀察[J]. 廣州醫學院學報, 2007, 35(4)：54-56.

[10] 杜納納, 許丹丹, 黃莉莉, 等. 去卵巢和性成熟期ICR小鼠動情周期的觀察[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(12)： 2301-2304 .

[11] 張森, 王新, 韋旭斌, 等. 大鼠發情周期各階段的陰道細胞變化觀察[J]. 動物醫學進展, 2006, 27(2)：69-72.

[12] 李娟, 李芝蘭. BALB/c系小鼠動情周期的觀察[J]. 甘肅科技情報, 1996, 12(3)：31.

[13] 王潔, 吳素慧, 尚海霞, 等. 性成熟雌性SD大鼠動情周期的觀察[J], 當代醫學, 2013, 19(28)：25-26.

[14] 楊秀文, 李曉英, 金煥榮, 等. 苯乙烯對生殖內分泌和動情周期的影響[J]. 癌變·畸變·突變, 1995, 7(6)：358-360.

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0300-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.009

2017-02-09

胡文娟(1990-), 女, 技師, 本科, 從事熒光裸小鼠的育種與科研。E-mail： 452665670@qq.com

惲時鋒(1965-), 男, 教授, 從事醫學實驗動物學專業。E-mail： yunshifeng1@163.com