玉米葉片硝酸還原酶活性測定方法的優(yōu)化

宋月+崔婷婷+武麗娟

摘要：以玉米（Zea mays L.）自交系許178為材料，通過考察研磨方法、NADH用量、溫度、pH、反應時間、顯色時間對玉米葉片硝酸還原酶活性的影響獲得最優(yōu)試驗條件。結果表明，石英砂研磨比液氮研磨測得的酶活性高；反應溫度35 ℃、pH 7.5為較適反應條件；反應時間和顯色時間均為10 min時測得的硝酸還原酶活性與標準方法相比無顯著差異；還原劑NADH用量減少至一半測得的硝酸還原酶活性與標準方法無顯著差異。綜上所述，玉米葉片硝酸還原酶活性測定的優(yōu)化處理方案為用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的條件下反應10 min，顯色10 min。

關鍵詞：硝酸還原酶；玉米（Zea mays L.）葉片；測定條件；優(yōu)化

中圖分類號：S513 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2817-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.005

Abstract： In order to get the optimal experimental conditions，taking maize （Zea mays L.） inbred lines Xu178 as material，the effects of grinding methods，dosage of reductant NADH，reaction temperature，reaction time，pH and color developing time on nitrate reductase of maize leaves were studied. The results showed that Quartz sand grinding has higher activity than liquid nitrogen. The optimal reaction temperature was 35 ℃ and the optimal pH value was 7.5. There were no significant differences between the standard method and the reaction conditions that reaction time and coloration time were both 10 min， and also no significant differences between the half dosage of the reducing agent NADH and the standard methods dosage. In conclusion，the optimal experimental conditions to assay nitrate reductase activity of the maize leaves were that Quartz sand grinding，the reaction temperature was 35 ℃，the pH value was 7.5，the reaction time was 10 min，the color developing time was 10 min and dosage of reductant NADH was 0.15 mL.

Key words： nitrate reductase； maize （Zea mays L.） leaves； determination conditions； optimization

氮素是玉米（Zea mays L.）生長發(fā)育所需同化物質的主要來源，對玉米產(chǎn)量起著至關重要的作用[1]。硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）是植物體氮素同化和代謝過程的首個關鍵限速酶[2-5]，在植物高效利用氮素過程中具有重要的生物學地位，因此NR活性的高低可以反映植株的氮素營養(yǎng)狀況和氮代謝水平[6]。研究不同玉米品種葉片NR活性的差異是反應氮效率的一個重要生理指標[7-12]。

目前報道的測定植物葉片NR活性的方法主要有活體法[13]和離體法[14]。活體法操作相對簡單、快速，但是存在測定值偏低、重復性不夠理想的缺點，因此在科研試驗上應用較多的還是離體法。離體法操作步驟繁瑣，在測定過程中需要嚴格控制各項操作條件，同時對于不同的植物葉片，需要的試驗條件也會有所差異。本研究以玉米自交系許178穗位葉為試驗材料，對研磨輔助材料、研磨時間、反應溫度、反應時間、還原劑用量及pH共6個因素設置不同處理，以期篩選出玉米葉片NR活性測定的最佳方法，從而為玉米氮高效研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料取自陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學西卜村新品種示范園中進行田間試驗的玉米自交系許178。于2015年7月20日，在玉米吐絲后一周時取長勢均勻一致的植株穗位葉葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存，用于NR活性的測定。

1.2 處理因素及設計

參考《植物生理學實驗指導》[15]離體法測定植物葉片NR活性的方法，針對不同的研磨方法、NADH（Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen）用量、溫度、pH、反應時間、顯色時間設置不同的處理，每個處理進行3次重復，并設空白對照。用Tecan M200型全波長酶標儀測定硝酸還原酶活性。

1.2.1 研磨方法對NR活性的影響 參考文獻[15]給出的研磨方法是把植物葉片放在研缽里面，加入少量石英砂和緩沖液后手動研磨。作者在采用此方法測定NR活性的時候發(fā)現(xiàn)該方法研磨速度較慢，大批量測定時影響試驗效率。因此，為了提高研磨速度，設置了一個液氮研磨的處理，旨在探討不同研磨方法是否對NR活性測定有所影響。endprint

1.2.2 NADH用量對NR活性的影響 在標準方法加入0.30 mL NADH的基礎上，另外設置了0.45、0.15、0.10 mL幾個梯度，目的在于了解NADH用量對NR活性測定的影響。

1.2.3 pH對NR活性的影響 酶的活性不僅受到溫度的影響，還受到其他因素的影響，pH就是其中的1個重要因素，本試驗設置了7.0、7.5、8.0 3個pH梯度，以確定玉米NR還原反應的最適pH。

1.2.4 反應溫度對NR活性的影響 反應溫度是最重要的影響因素，本試驗設置了20、25、30、35、40 ℃ 5個酶活反應溫度梯度，目的在于確定玉米NR還原反應的最適溫度。

1.2.5 反應時間對NR活性的影響 在標準方法給出的反應時間30 min基礎上，另外設置了40、20、10、5 min的反應時間，目的在于確定縮短反應時間是否會影響玉米NR活性的測定。

1.2.6 顯色時間對NR活性的影響 在標準方法給出的顯色時間15 min基礎上，另外設置了5、10、20、25 min 4個酶活顯色時間梯度，目的在于確定最佳的顯色時間。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 NR活性測定采用標準曲線法，從標準曲線中檢出NO2-含量（μg/mL），以每小時每克鮮重產(chǎn)生NO2-的量表示酶活性，計算方法：

式中，C0和C1分別為試驗初始和試驗過程中根據(jù)標準曲線求的得NO2-量；Vt為反應液總體積；Vs為測定時取樣體積；FW為鮮重；t為反應時間。

用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 研磨方法對NR活性的影響

選用了液氮研磨法和石英砂研磨法2種方法，結果如圖1所示。盡管采用液氮研磨法速度較快，可以提高試驗效率，但是測得的NR活性比石英砂法顯著降低。因此，為了保證試驗結果的可靠性和準確性，采用石英砂研磨法。

2.2 還原劑NADH量對NR活性的影響

不同的樣品，其NR活性不同，對于不同的樣品質量，NR的活性也是不同的[13]，因此所需NADH的量也各不相同。本試驗采用了4個不同的NADH用量，試驗結果如圖2所示。從圖2可以看出，0.45、0.15 mL NADH與0.30 mL用量的NR活性無顯著差異，0.10 mL NADH與0.30 mL NADH處理間差異顯著，說明將NADH用量減少到0.15 mL對試驗結果無顯著影響，同時增加其用量對試驗也無影響，為節(jié)約成本，可將NADH的用量減少到0.15 mL。

2.3 不同pH對NR活性的影響

pH是影響酶活性的重要因素之一，只有在特定的pH條件下，酶才能夠表現(xiàn)出最大的活性。過酸或過堿不僅會降低酶的活性，有時甚至會使酶的活性喪失。由圖3可知， pH 7.5時NR的活性最大，說明其最適pH為7.5，且與pH為7.0、8.0相比，差異達到顯著水平。

2.4 不同溫度對玉米NR活性的影響

在一定條件下，每種酶都有其最適反應溫度，低于或高于其最適反應溫度都會降低酶的活性。同時，對于相同的酶，不同的植物可能其最適反應溫度也有不同。《植物生理學實驗指導》[15]給定的溫度是25 ℃，但在預試驗的基礎上以及有試驗證明該酶的最適溫度為30 ℃[16，17]。因此，本試驗設置了20、25、30、35、40 ℃的溫度梯度，結果（圖4）表明，溫度在35 ℃時NR的活性最大，而且與其他溫度差異顯著，表明35 ℃為玉米NR的最適反應溫度。

2.5 不同反應時間對NR活性的影響

從圖5可以看出，反應時間為20、10 min時測得NR的活性與30 min時測得的酶活性無顯著差異，反應時間為5、40 min時測得的NR活性與30 min測得的NR活性差異顯著。因此為了快速準確地測定酶的活性，10 min是較好的反應時間。

2.6 不同顯色時間對NR活性的影響

由圖6可知，5 min的顯色時間與其他4個時間測定的NR活性差異顯著，而其他4個時間點測定的NR活性差異不顯著。因此為了節(jié)約時間，提高測定效率，可以把顯色時間縮短至10 min。

3 討論

3.1 硝酸還原酶測定中較佳的研磨方法是石英砂研磨法

本試驗結果表明，石英砂研磨法比液氮研磨法對NR活性的測定更為合適，原因可能是液氮的超低溫對葉片中的NR活性產(chǎn)生影響。在超低溫下，酶的活性可能會徹底喪失，或酶在超低溫下活性降低后難以恢復，從而影響酶活性的測定。與液氮研磨法相比，石英砂研磨法的溫度適中，酶活性損失較少。因此對于硝酸還原酶活性的測定，石英砂研磨法是較好的選擇。

3.2 適當降低NADH用量對硝酸還原酶的測定結果沒有影響

NADH作為生物體中提供還原力的一種物質，對植物的生命活動影響重大，是必不可少的。在NR的測定過程中，NADH的用量對酶活性的測定也具有影響。因此，本試驗針對其用量進行了探討。本試驗結果表明，NADH的用量由0.30 mL增加至0.45 mL，對結果無影響，減少其用量至0.15 mL時，對酶活性的測定影響較小，但當加入量為0.10 mL時，測得的酶活性顯著降低。原因可能是在一定的提取液中，對酶的提取量是一定的。對于玉米穗位葉NR活性的測定，0.15 mL的NADH是足夠的，因此增加NADH加入量對酶活性的測定沒有顯著差異；但當?shù)陀?.15 mL時，由于還原力不夠，酶活性顯著降低。因此，為節(jié)省成本，可以在不影響試驗結果的同時適當減少NADH用量。

3.3 硝酸還原酶活性測定最適溫度為35 ℃，最適pH為7.5

試驗結果表明，玉米NR活性測定的最適還原溫度是35 ℃，低于或高于這個溫度都不能很好地測定NR的活性。同時發(fā)現(xiàn)與Averina等[18]、王學穎等[19]、劉潔等[20]、齊艷玲等[21]等的研究結果并不一致，與周樹等[13]研究結果一致。這可能是因為NR作為一種酶，除了受遺傳因素的決定以外，還受到多種環(huán)境因素的影響，如光、無機鹽、水分和外源激素等環(huán)境因素的影響；此外，試驗場地、季節(jié)、測定品種等也可能影響其結果。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)NR對溫度特別敏感，在測定該酶活性時要特別注意溫度的調控，盡量使酶處于這個溫度。同時酶活力受環(huán)境pH的影響，在一定的pH下，酶表現(xiàn)出最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低。pH影響酶活力的原因可能是過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，從而影響了酶活性部位的構象，進而影響酶的活性。因此對其進行探討，得出該酶的最適反應pH為7.5，與齊艷玲等[21]、王學穎等[19]的結論一致，說明中性偏堿性條件有利于玉米葉片NR活性的測定。endprint

3.4 適當降低顯色時間和反應時間對硝酸還原酶的測定沒有影響

在酶活性測定過程中，顯色時間和反應時間對酶活性的測定也具有一定的影響。顯色時間過短，亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應不能充分進行，得出的酶活性偏低；顯色時間過長，則浪費了許多時間，試驗效率低。同時也發(fā)現(xiàn)，反應時間的長短也會對酶活性的測定產(chǎn)生影響，反應時間過短，反應不能充分進行，測得的酶活性低；反應時間過長，也會使測得的酶活性降低。因此在本次試驗中，對反應時間和顯色時間進行了優(yōu)化設計。試驗中共設了5個顯色時間梯度進行研究探討，結果表明，將顯色時間降低到10 min對NR活性的測定結果無顯著影響；但當顯色時間降低到5 min時，酶活性顯著降低，其原因可能是時間太短，反應還未充分進行，說明亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應可能在5～10 min已反應完全，之后反應液的顏色不會發(fā)生顯著變化，即反應液的吸光度也沒有顯著變化。因此，為了節(jié)省時間，可以將顯色時間縮短到10 min。同時對反應時間進行了優(yōu)化，當縮短至20 min和10 min時對酶活性的測定結果沒有影響，與Férrario-Mery等[22]的反應時間一致；但當將反應時間提高到40 min時，測定結果顯著降低，說明30 min酶活反應已經(jīng)完全結束，再延長時間已無意義，只會降低測定的結果。因此，為了提高試驗效率，可以把反應時間縮短至10 min。

4 結論

分別對硝酸還原酶活性測定過程中幾個重要因素設置不同處理，篩選出快速、準確、又節(jié)約成本的玉米葉片硝酸還原酶測定的最佳試驗條件為用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的條件下反應10 min，顯色10 min。該方法不僅能快速準確地測定玉米硝酸還原酶活性，而且可以節(jié)約時間和成本。

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