窖泥理化指標與微生物含量相關性研究

高家坤 李靜心 何宏魁,,3 李安軍,,3 宰紅玉

窖泥理化指標與微生物含量相關性研究

高家坤1李靜心2何宏魁1,2,3李安軍1,2,3宰紅玉1

窖泥是生產濃香型白酒的基礎，窖泥質量的優劣對濃香型白酒的質量起著至關重要的作用。本研究利用qPCR技術對濃香型白酒窖泥微生物含量進行測定，同時結合常規理化指標進行相關性分析。結果表明，pH與窖泥細菌含量呈正相關（P＜0.01），腐殖質含量與窖泥細菌含量呈負相關（P＜0.05），說明窖泥pH和腐殖質含量可作為衡量微生物含量的理化指標。

濃香型白酒的生產以泥窖窖池為基礎，發酵過程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區系在糟醅固、液、氣三相界面的復雜的物質能量代謝過程。在濃香型白酒窖池發酵過程中，大曲微生物、窖泥微生物與糟醅微生物區系的形成和演變左右著發酵過程中窖池內微生物物質能量代謝的走向，與濃香型白酒獨特風格的形成息息相關。但長期以來，由于受到科研力量分散以及技術手段落后的限制，廣大科研工作者對發酵過程中窖泥微生物區系的研究和認識還非常有限。

實時熒光定量PCR是一種核酸定量技術，此技術是在PCR反應體系中引入了熒光基團，通過檢測PCR過程中熒光信號的積累實時監控整個過程，最終通過標準曲線對未知模板進行定量。熒光定量PCR技術雖然已經廣泛應用于微生物的研究中，但在窖泥微生物中的應用較少。張勁等使用qPCR技術對不同窖齡窖泥中主要產甲烷菌群進行研究，探討了菌群含量與窖齡的關系；胡貝利用qPCR技術對古菌、細菌及相關菌群在不同酒廠不同窖齡窖泥中的拷貝數進行了分析，這些qPCR對窖泥的研究結果為本研究提供了依據。

窖泥是生產濃香型白酒的基礎，窖泥質量的優劣對濃香型白酒的質量起著至關重要的作用。本研究對濃香型白酒窖泥的各項理化指標進行研究，同時結合qPCR技術對窖泥微生物含量進行分析，通過SPSS對窖池的理化指標與微生物含量進行相關分析，試圖尋找二者之間的相關性。

材料與方法

材料

樣品采集。隨機抽取12個窖池，每個窖池取池底窖泥250g。窖泥取樣方式為五點取樣法。取1g窖泥提取DNA，200g窖泥測定理化指標，其余窖泥樣品-80℃凍存。

試驗試劑。50×TAE溶液，上海生工Agarose M，TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒，，TAKARA SYBR Fast qPCR Mix。

試驗儀器。UVP高級化學發光成像工作站，賽多利斯G-26C高速冷凍離心機，北京六一電泳儀，Thermo qPCR儀及耗材，Thermo離心機，Nano核酸微量測定儀。

試驗方法

樣品總DNA的提取。樣品基因組的提取按照TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒操作說明提取，提取的DNA置于-20℃保存。

樣品理化指標的測定。取200g新鮮窖泥樣，測定其水分、pH值、銨態氮、有效磷、腐殖質、脫氫酶活性等常規理化指標。

水分（含揮發分）測定：稱取20g新鮮窖泥樣品，置于135℃烘箱中烘干2h，取出后置于干燥器內自然冷卻，稱量冷卻后樣品的質量，計算窖泥水分含量。

pH測定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入50mL H2O，混勻30min后用pH計測定窖泥pH值。

銨態氮測定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入10% NaCl溶液定容至250mL，30min后吸取5mL上清液置于擴散皿，內圈加入2mL硼酸溶液，外圈加入2mL 40% NaOH溶液，混勻并在室溫下靜置24h， 硫酸標準溶液滴定并計算窖泥中銨態氮的含量。

脫氫酶活性：參考文獻所述方法。

有效磷的測定：參考文獻所述方法。

腐殖質測定：稱取2g風干窖泥，加入70mL堿性焦磷酸鈉溶液，沸水浴提取30min后定容至100mL。吸取5mL上清液加入等體積0.8M 重鉻酸鉀和15mL濃硫酸，沸水浴30min后加入20mL蒸餾水和鄰菲羅啉指示劑，硫酸亞鐵滴定并計算窖泥中腐殖質的含量。

微生物含量的測定。本試驗采用引物GJ-F 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和GJ-R 5’-ATTACCGCG GCTGCTGG-3’ 擴增細菌16S rDNA基因，擴增片段約177bp。以每個窖池的DNA樣品為模板進行qPCR，通過標準曲線計算得到每條窖池細菌的拷貝數。qPCR反應體系（10uL）：2×qPCR mix 5μL，GJ-F 0.5μL，GJ-R 0.5μL，dd H2O 3μL，DNA模板1μL。qPCR反應循環條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸10s，變性、退火、延伸進行40個循環，反應結束后制作熔解曲線。

數據處理。使用SPSS軟件對窖泥理化指標和窖泥細菌含量進行相關性分析，擬找出與窖泥細菌含量相關的理化指標。

結果與分析

窖泥理化指標的測定

對12個窖泥樣品的常規理化指標進行測定，分別測定了水分、pH值、銨態氮、腐殖質、脫氫酶活性等常規理化指標（表1）。結果表明，水分、有效磷、腐殖質等常規理化指標變化不大，pH、銨態氮和脫氫酶活性在各個窖池間有一定差距，這些指標的差異可能是窖池間差異的主要原因。

表1 窖泥常規理化指標的測定結果

窖泥細菌含量

使用qPCR制作標準曲線，對12個樣品窖泥中的細菌含量進行分析檢測，分析細菌在不同窖池中的含量情況，結果見表2。結果表明，各窖池細菌含量均超過109，但不同窖池間的細菌含量有所差別，細菌含量最高的5號窖池與含量最低的12號窖池之間相差接近100倍，說明不同的窖池之間存在細菌含量的差異，這種差異可能是造成窖池間差異的直接原因。

表2 窖泥細菌的qPCR測定結果

理化指標與細菌含量的相關性研究

使用SPSS 22.0軟件對窖泥理化指標與細菌含量進行相關性分析，結果見表3。結果表明，pH和細菌含量相關性較高（圖1），達到了0.771（P＜0.01），腐殖質含量與細菌含量相關性稍低，為-0.613（P＜0.05），其他理化指標與細菌含量不具有相關性。經分析，這是由于窖池中微生物的最適pH值為弱酸性，當pH值偏低時總酸含量也隨之增高，影響了微生物的生長，從而使得微生物含量偏低。腐殖質是窖泥微生物的重要養分，微生物含量越豐富，腐殖質的利用率越高，微生物含量越低，窖泥中腐殖質的殘留就越高，因此腐殖質與細菌含量呈負相關。

表3 窖池環境因子與細菌含量的相關性

圖1 pH與細菌含量的相關性

本試驗利用qPCR技術對濃香型白酒窖泥微生物含量進行了定量，同時結合窖泥理化指標進行相關性分析，發現pH與窖泥細菌含量呈正相關（P＜0.01），腐殖質含量與窖泥細菌含量呈負相關（P＜0.05）。本試驗的結果表明窖泥的pH和腐殖質含量可以作為直接衡量窖泥微生物含量的理化指標，方便了在生產過程中對窖泥的質量進行評價。

(作者單位：1. 安徽古井貢酒股份有限公司；2. 安徽省固態發酵工程技術研究中心；3. 安徽瑞思威爾科技有限公司)