微流體裝置線性去除豬MII期卵母細胞冷凍保護劑的實驗研究

周新麗 楊 云 戴建軍 張德福 邵文琪 衣星越 陶樂仁

1(上海理工大學生物熱科學研究所，上海 200093)2(上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106)

微流體裝置線性去除豬MII期卵母細胞冷凍保護劑的實驗研究

周新麗1*楊 云1戴建軍2張德福2邵文琪1衣星越1陶樂仁1

1(上海理工大學生物熱科學研究所，上海 200093)2(上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106)

低溫保存后的卵母細胞在使用前必須要去除冷凍保護劑，目前常用的分步法去除步驟繁瑣，容易丟失細胞，而且會對細胞造成致命的滲透損傷。為減小細胞滲透損傷，設計制作適合卵母細胞保護劑去除的微流體裝置，研究微流控線性法去除豬MII期卵母細胞低溫保護劑時在不同時間(6、8、10 min)下卵母細胞的體積變化，以及對卵母細胞存活率與發育率的影響；并與傳統的去除方法(一步法和分步法)進行比較。結果表明，采用微流體裝置線性去除冷凍保護劑，8 min為實驗中的最優去除時間；線性法能夠明顯減小細胞的滲透損傷，其最大歸一化滲透膨脹體積為1.12±0.07，卵母細胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別達到83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法(P<0.05)。因此，微流控線性去除冷凍保護劑能夠顯著減小細胞的滲透損傷，為卵母細胞低溫保存技術提供新思路。

微流體；混合；卵母細胞；冷凍保護劑；滲透損傷

引言

卵母細胞的低溫保存在人類的輔助生殖領域及優良品種畜禽種質資源的保存方面都具有重要的意義[1-2]。在細胞低溫保存過程中，需要添加冷凍保護劑來抑制冰晶對細胞的損傷[3]。然而，由于保護劑自身具有化學毒性，復溫后的細胞不能直接使用，必須要將保護劑稀釋或去除。冷凍保護劑的去除過程與加載過程一樣，由于胞內外滲透壓的變化，大量的水或保護劑會快速流入或流出細胞，從而引起細胞體積的劇烈變化，對細胞造成明顯的滲透損傷[4-6]。目前，研究者對冷凍保護劑的加載過程已經做了大量的優化研究，包括保護劑濃度、添加步驟、每一步的平衡時間、溫度等[7-9]。與加載過程相比，去除過程的研究就顯得薄弱很多。Liu等和Coticchio等模擬發現，冷凍保護劑的去除過程對細胞的滲透損傷要遠大于其他步驟，縮短冷凍保護劑的去除程序可能會減少細胞的滲透損傷[10-11]。因此，有必要對細胞冷凍保護劑的去除方法進行改進，從而進一步提高其低溫保存的效果。

近年來，為減小保護劑去除過程對細胞的滲透損傷，提高細胞冷凍保護劑的去除效率，研究學者也提出了一些新方法。張曉光等采用透析法來去除紅細胞滲透性低溫保護劑(甘油)，結果表明該方法能夠快速有效地去除紅細胞內的低溫保護劑，去除后紅細胞的回收率為(89.17±2.46)%，血紅蛋白回收率為(84.93±4.64)%，細胞懸浮液的滲透壓(殘留甘油的含量)為(340.33±20.56)mOsm[12]。Mata等和Hanna等[15]提出采用微流體裝置去除臍帶血低溫保護劑，分別制作了水平兩流和垂直三流的微流體裝置，驗證了微流體裝置去除冷凍保護劑的效率[13-15]。結果表明，微流體裝置能夠通過擴散作用實現保護劑的去除，但是要達到較大處理量和95%以上的去除率則需要采用多級串聯的方式。與傳統的離心去除法相比，這些方法明顯減小了細胞的丟失率，改善了胞內保護劑的去除效率，但僅適用于處理大量的小體積細胞，對于卵母細胞并不適合。因為卵母細胞體積較大，直徑大于100 μm，在臨床上多以單個細胞操作。目前，對于卵母細胞冷凍保護劑，通常采用分步去除的方法。盡管分步法對細胞的損傷小于一步法，但是分步法的實際操作程序比較繁瑣，同時細胞在不同的溶液間不斷轉移，容易造成細胞丟失，而且細胞仍然會經歷多次的體積驟變[16]。關于微流體裝置用于卵母細胞冷凍保護劑去除，這類的相關研究還未見報道。

筆者設計制作了一個特殊的微流體裝置，用于豬MII期卵母細胞冷凍保護劑(Me2SO)的去除研究。首先，對微流體線性法去除時間進行優化，分析了不同去除時間(6、8、10 min)下卵母細胞的體積變化，以及對卵母細胞存活率與發育率的影響；然后，比較了不同去除方式(一步法、兩步法、三步法、微流體線性法)下卵母細胞的體積變化，以及對卵母細胞存活率與發育率的影響，確定微流體裝置用于卵母細胞冷凍保護劑去除的有效性，以期為卵母細胞保護劑去除方案的設計和優化提供指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組織培養液(tissue culture medium 199, TCM199)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)、二甲基亞砜(Me2SO)、蔗糖、山梨醇、醋酸鈣、醋酸鎂，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司，美國。實驗中所用其他試劑除特別說明外，均購自美國Sigma公司。

1.2 玻璃化冷凍/解凍液

實驗中所用溶液的溫度為37℃，濃度為體積比濃度。基礎液：TCM199+20% FBS。玻璃化冷凍液：(VS1)基礎液+15% Me2SO；(VS2)基礎液+30% Me2SO。一步法解凍液：基礎液。兩步法解凍液：(WS1)基礎液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基礎液。三步法解凍液：(WS1)基礎液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基礎液+0.5 mol·L-1蔗糖，(WS3)基礎液。微流控線性法解凍液：基礎液+1 mol·L-1蔗糖。

1.3 豬卵母細胞的采集及MII期卵母細胞的獲得

從上海市嘉定區某屠宰場采集新鮮豬卵巢組織，放在37℃含1 000 μg/mL的雙抗生理鹽水中，1 h內運回實驗室。用生理鹽水沖洗2～3次，選擇卵巢表面直徑為2～ 6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器將卵母細胞復合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的液體置于10 mL的離心管中，在39.5℃的恒溫水浴中靜置15～20 min，移除上清液。 取胞質均勻且有3層以上致密卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合體，即GV期卵母細胞。將GV期卵母細胞洗滌3次后，置于已平衡4 h以上的成熟培養液中，培養液為TCM199+10% FBS+10% 豬卵泡液+0.1% 血清促性腺激素(PMSG)+ 0.1% 人絨毛膜促性腺激素(hCG)，然后再放入CO2培養箱((39±0.5)℃、5% CO2，BC-J160S，上海博訊實業有限公司，中國)中，成熟培養44 ～ 46 h，得到MII期卵母細胞。 MII期卵母細胞用0.1%透明質酸酶消化，以去除卵丘細胞，再用TCM199洗滌3 ～ 5次備用。

1.4 微流體芯片的設計與制作

用于卵母細胞冷凍保護劑去除的微流體芯片如圖1(a)所示，主要包括流體混合通道、細胞分析腔、細胞出入通道等。蛇形混合通道的尺寸為長100 mm×寬150 μm×高150 μm，解凍液和基礎液在通道內層流擴散混合，實現解凍液濃度的連續線性變化。細胞分析腔的尺寸為長1 200 μm×寬1 000 μm×高150 μm，卵母細胞經細胞通道導入細胞分析腔。為了防止卵母細胞被流體沖走，在細胞分析腔的內部加工了兩排直徑為100 μm的柱狀障礙物，障礙物之間的間距為50 μm，如圖1(b)所示。

圖1 用于卵母細胞冷凍保護劑去除的微流體裝置結構。(a)微流體芯片；(b)細胞分析腔Fig.1 The structure diagrams of microfluidic chip used oocyte unloading for CPA. (a)Microfluidic chip; (b)Oocyte analysis chamber

微流體芯片是通過模塑法來制作的。首先在硅晶片上利用光刻膠得到微流控芯片結構的光刻模具，再將PDMS和固化劑混合均勻并澆注在模具上，等完全固化后將PDMS材料從模具上剝落下來，得到刻有微通道的微流控芯片基片；將PDMS基片和PDMS蓋片對齊符合完成封接，然后放在75℃的烘箱中加熱10 min，得到牢固的PDMS芯片；最后在芯片的制定位置處用鉆孔器打4個直徑為0.6 mm的孔，用塑料管連接注射泵和口吸器，使流體和細胞順利進出微流體芯片。

1.5 用于卵母細胞冷凍保護劑連續去除的微流控實驗系統

圖2是實現卵母細胞冷凍保護劑連續去除的實驗系統，主要由微量注射泵(Pump 11 Plus微量注射泵，Harvard，美國)、微量進樣器(1 mL微量進樣器，上海高鴿工貿有限公司，中國)、倒置熒光顯微鏡(TS100倒置熒光顯微鏡，Nikon，日本)、微流體芯片以及廢液瓶等組成。在導入卵母細胞之前，先將1 mol·L-1的蔗糖溶液充滿混合通道，然后將加載過Me2SO的卵母細胞吹進細胞分析腔內并開啟注射泵，通過注射泵分別將解凍液和基礎液注入微流體芯片內。由于蔗糖溶液的黏度較大，為保證溶液在微通道內順暢流動，并實現解凍液濃度的線性變化，實驗中選擇混合通道內溶液的總流量為5 μL/min，即控制基礎液的流量從0 μL/min增加到5 μL/min，同時解凍液的流量從5 μL/min減小到0 μL/min，去除時間為8 min。在去除過程中，連續記錄細胞體積的變化。去除結束后，將卵母細胞從細胞腔內吸出，進行細胞存活率及發育率的實驗。

圖2 微流體裝置用于冷凍保護劑去除的系統Fig.2 The system diagram of CPA unloading with microfluidic device

1.6 實驗設計

為了研究冷凍保護劑去除過程對豬MII期卵母細胞滲透損傷的影響，以下兩組實驗中冷凍保護劑(30% (V/V) Me2SO)的加載都采用相同的方法——兩步法，就是將卵母細胞從基礎液中轉移至15% (V/V) Me2SO中平衡3 min，然后移至30% (V/V) Me2SO中平衡30 s，完成冷凍保護劑的加載，備用。

實驗1：對微流控線性法去除冷凍保護劑的時間進行優化，通過注射泵控制流體流量，使腔體內胞外解凍液的濃度分別在6、8、10 min內，從1 mol·L-1線性減小到0 mol·L-1，具體的去除程序如圖3(a)所示。

圖3 實驗方案。(a)不同時間的線性法去除方案;(b)4種不同的保護劑去除方式Fig.3 Experiment protocols in this study. (a) Linear protocols to different unloading duration; (b) Four different CPA unloading protocols

實驗2：采用一步法、兩步法、三步法、線性法4種不同的方式去除卵母細胞冷凍保護劑，具體的去除程序和去除時間如圖3(b)所示。一步法：將卵母細胞直接轉移至基礎液中平衡8 min。兩步法：將卵母細胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，然后移至基礎液中平衡6 min。三步法：將卵母細胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，再移至0.5 mol·L-1蔗糖溶液中平衡3 min，然后轉移至基礎液中平衡3 min。線性法：將卵母細胞導入細胞分析腔內，控制胞外解凍液濃度從1 mol·L-1線性減小到0 mol·L-1，去除時間設定為8 min。

1.7 細胞圖像采集與數據處理

在冷凍保護劑去除過程中，用帶有圖像采集系統的顯微鏡連續記錄并獲取整個過程中細胞(n=5)的體積變化圖片。假設卵母細胞為理想球體，利用圖像分析軟件測量細胞的二維投影面積，再通過球體體積與投影面積的換算關系式(V=0.752S3/2)，計算得到細胞的體積變化。

1.8 細胞存活率與發育率判斷

按照實驗中設計的方案去除冷凍保護劑后，將卵母細胞轉移至培養液中，放入CO2培養箱孵育1 h，然后將一部分細胞用熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate, FDA)染色5 min，再用TCM199洗3～5遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察是否著色。有強熒光反應的為活卵，無熒光反應或弱熒光反應的為死卵。活卵數與細胞總數之比為存活率。將另一部分細胞進行孤雌激活，激活后的細胞轉移至胚胎培養液中，然后放入CO2培養箱培養。分別在培養的第2、7天觀察細胞卵裂率和囊胚率。

1.9 數據分析

每組實驗至少重復3次，試驗數據采用Mean±SD表示，并用SPSS Statistics 13.0 軟件進行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異標準。

2 結果

2.1 不同去除時間下卵母細胞體積變化

圖4 微流控線性法不同去除時間下MII期豬卵母細胞的體積變化Fig.4 Volumetric responses of MII porcine oocyte to different unloading duration with linear method

圖4表示微流控線性法不同去除時間下卵母細胞的體積變化。可以看出，在采用3種不同的去除時間時(6、8、10 min)，細胞體積都呈現先增大后減小的變化趨勢，其中最大歸一化滲透膨脹體積依次分別為1.18±0.02、1.12±0.07、1.07±0.01。當細胞達到滲透平衡時，6和8 min處理后細胞的體積基本能夠恢復到初始體積。然而，對于10 min去除方案來說，從150 s之后細胞體積開始突然減小，其最終歸一化體積為0.87±0.03。因此，8 min去除時細胞體積的改變量較小，細胞受到的滲透損傷較小，該時間為實驗中的最佳去除時間。2.2 不同去除時間對卵母細胞存活率與發育率的影響

表1呈現了微流控線性法不同去除時間對卵母細胞存活率與發育潛能的影響。可以看出，線性法處理后細胞的存活率和發育潛能都顯著低于新鮮組，說明該方法仍會對細胞造成一定的損傷。8 min去除方案下細胞的存活率和卵裂率分別為88.7%、72.5%，都顯著高于另外兩種去除方案(6和10 min)。然而，8 min去除方案下卵母細胞的囊胚率為21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，但三者之間并無顯著性差異。

表1 微流控線性法不同去除時間對MII期豬卵母細胞存活率與發育率的影響

Tab.1 Effects of the different unloading durations with microfluidics on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

組別存活率/%卵裂率/%囊胚率/%對照組(n=127)97.7±4.2a85.4±3.4a30.7±6.1a6min(n=121)72.9±0.5b64.6±0.4b20.2±1.8b8min(n=118)88.7±6.8c72.5±3.9c21.5±3.7b10min(n=88)79.5±2.2d54.4±6.2d18.4±9.4b

注：不同字母表示組之間有顯著性差異，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

圖5 4種不同去除方式下豬MII期卵母細胞的體積變化Fig.5 Volumetric responses of MII porcine oocyte under four different CPA unloading protocols

2.3 不同去除方式下卵母細胞的體積變化

圖5表示采用不同的方式去除胞內保護劑Me2SO時卵母細胞的體積變化。可以看出，用一步法、兩步法、三步法和線性法去除冷凍保護劑時，細胞體積都呈現先增大后逐漸減小的變化趨勢。采用一步法去除保護劑時，卵母細胞的歸一化最大滲透體積達到了1.92±0.04，同時，當細胞達到滲透平衡時，其體積也不能恢復到初始體積。與一步法相比，分步法和線性法去除冷凍保護劑時，卵母細胞體積的膨脹程度明顯減小，細胞的最大歸一化滲透體積分別為1.33±0.05、1.12±0.07。線性法去除冷凍保護劑時，細胞體積的變化曲線更平緩，說明微流體法對細胞的滲透損傷要小于一步法和分步法。2.4 不同去除方式對卵母細胞存活率與發育率的影響

為了探究微流體法用于卵母細胞冷凍保護劑去除的有效性，比較了一步法、兩步法、三步法及線性法4種不同的去除方式對豬MII期卵母細胞存活率和發育潛能的影響，結果見表2。兩步法和三步法去除保護劑時卵母細胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為(62.5%、48.6%、10.3%)和(71.4%、50.3%、12.7%)，都顯著高于一步法(15.2%、0、0)。然而，兩步法和三步法在卵母細胞的發育率方面無顯著性差異，說明分步步數的增加并不能改善細胞的發育率。采用線性法去除冷凍保護劑后，卵母細胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別為83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法，說明線性法對細胞的滲透損傷最小，用于卵母細胞冷凍保護劑的去除是有效的。

表2 冷凍保護劑不同去除方式對MII期豬卵母細胞存活率與發育率的影響

Tab.2 Effects of different CPA unloading protocols on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

組別存活率/%卵裂率/%囊胚率/%對照組(n=176)(96.8±2.1)a(85.8±1.0)a(41.46±1.5)a一步法(n=121)(15.2±3.6)b0.0±0.0b0.0±0.0b兩步法(n=104)(62.5±1.0)c(48.6±8.4)c(10.3±2.5)c三步法(n=117)(71.4±1.2)d(50.3±14.6)c(12.7±2.2)c線性法(n=72)(83.6±6.1)e(72.4±3.9)e(21.5±3.7)e

注：不同字母表示組之間有顯著性差異，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

3 討論

本研究首先對微流體線性法去除時間進行了優化，實驗結果表明，隨著去除時間的增加，細胞體積的改變量越小，說明細胞所受的滲透損傷越小，這是因為隨著去除時間的延長，胞外緩沖液濃度(蔗糖濃度)的變化梯度減小，縮小了胞內外滲透壓差，從而減小了細胞膨脹所帶來的滲透損傷[17]。但采用10 min方案去除冷凍保護劑時，反而會對細胞造成更大的損傷，處理后卵母細胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別僅為79.5%、54.4%、18.4%。究其原因，是10 min去除使得微通道內解凍液流量過小，流體雷諾數變小，層流邊界層變厚，溶液黏性力變大，有可能造成流體流動形態的改變[18]，從而使高濃度解凍液在細胞腔內聚集，導致細胞在高濃度溶液中暴露時間過長。另外，去除時間過長，冷凍保護劑的洗脫效率下降，細胞在高濃度保護劑中暴露的時間太長，保護劑對細胞的毒性損傷作用抵消了細胞體積變化小帶來的優勢，反而不利于細胞的低溫保存[17]。

采用不同方式去除胞內保護劑時，一步法的效果最差，細胞的最大滲透膨脹體積超過了其臨界體積[19-20]，從而造成細胞膜結構和細胞骨架系統的損傷，處理后細胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為15.2%、0、0。采用兩步法和三步法去除時，細胞體積的膨脹要明顯減小一步法，說明分步法顯著減小了細胞的滲透損傷[10,21]。Wang等比較了四步法添加、一步法和兩步法去除對牛MII期卵母細胞發育潛能的影響[22]，結果表明兩步法去除后細胞的卵裂率(62.6%)與一步法(60.4%)無顯著性差異，但囊胚率(11.1%)要顯著高于一步法(9.5%)。但分步去除冷凍保護劑時，細胞暴露在1 mol.L-1蔗糖溶液中，細胞的體積會出現先膨脹后收縮的現象，其原因可能是Me2SO分子快速流出細胞，使胞外溶液的濃度高于胞內，細胞開始逐漸脫水，與此同時，胞外的Me2SO分子與蔗糖分子相結合，抑制了水流入細胞。線性法去除對細胞的滲透損傷最小，處理后細胞的存活率、卵裂率、囊胚率都顯著高于一步法和分步法，這一結果與Song等采用微流體裝置加載并去除肝細胞低溫保護劑的方法[23]類似，處理后肝細胞的存活率比一步法高25%，比兩步法高10%。

4 結論

1)在37℃條件下，對于微流控線性法不同去除時間(6、8、10 min)，卵母細胞的體積都呈現先增大后減小的變化趨勢，其中8 min為實驗中的最優去除方案。該方案下細胞的存活率和卵裂率分別為88.7%、72.5%，均顯著高于6 min(72.9%、64.6%)和10 min(79.5%、54.4%)(P<0.05)，但囊胚率為21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，三者之間無顯著性差異(P>0.05)。

2)線性法去除冷凍保護劑，卵母細胞的體積變化曲線比較平緩，其最大歸一化滲透膨脹體積為1.12±0.07，明顯小于一步法(1.92±0.04)和分步法(1.33±0.05)。用線性法處理，卵母細胞存活率、卵裂率及囊胚率分別達到了83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法(P<0.05)，說明微流控線性法去除保護劑對細胞的滲透損傷最小，用于卵母細胞冷凍保護劑的去除是有效的。

[1] Chian RC, Wang Y, Li YR. Oocyte vitrification: advances, progress and future goals [J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2014, 31(4): 411-420.

[2] Zhou Xinli, Al-Naib A, Sun Dawen, et al. Bovine oocyte vitrification using the Cryotop method: effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development [J]. Cryobiology, 2010, 61(1): 66-72.

[3] 李維杰, 周新麗, 劉寶林, 等. 升降溫速率對低溫保護劑溶液結晶性質的影響 [J]. 化工學報, 2013, 64(8): 2969-2974.

[4] Woods EJ, Liu J, Pollok K, et al. A theoretically optimized method for cord blood stem cell cryopreservation [J]. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, 2003, 12(3): 341-350.

[5] 華澤釗，任禾盛. 低溫生物醫學技術 [M]. 北京：科學出版社, 1994: 166-169.

[6] Clark NA, Swain JE. Oocyte cryopreservation: searching for novel improvement strategies [J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2013, 30(7): 865-875.

[7] Karlsson JOM, Szurek EA, Higgins AZ, et al. Optimization of cryoprotectant loading into murine and human oocytes [J]. Cryobiology, 2014, 68(1): 18-28.

[8] 解政鼎, 馬學虎, 艾丹亭, 等. 低溫保護劑對神經干細胞球添加過程的模擬分析[J]. 化工學報, 2013, 64(11): 3956-3967.

[9] Liu Jun, Mullen S, Meng QG, et al. Determination of oocyte membrane permeability coefficients and their application to cryopreservation in a rabbit model [J]. Cryobiology, 2009, 59(2): 127-134.

[10] Liu Jun, Phy J, Yeomeans E. Theoretic considerations regarding slow cooling and vitrification during cryopreservation [J]. Theriogenology, 2012, 78(8): 1641-1652.

[11] Coticchio G. Truths and myths of oocyte sensitivity to controlled rate freezing [J]. Reproductive Biomedicine Online, 2007, 15(1): 24-30.

[12] 張曉光, 趙剛, 丁衛平, 等. 透析法去除紅細胞滲透性低溫保護劑的實驗研究 [J]. 中國生物醫學工程學報, 2008, 27(1): 156-159.

[13] Mata C, Longmire EK, Mckenna DH, et al. Experimental study of diffusion-based extraction from a cell suspension [J]. Microfluidics and Nanofluidics, 2008, 5(4): 529-540.

[14] Mata C, Longmire EK, Mckenna DH, et al. Cell motion and recovery in a two-stream microfluidic device [J]. Microfluidics and Nanofluidics, 2010, 8(4): 457-465.

[15] Hanna J, Hubel A, Lemke E. Diffusion-based extraction of DMSO from a cell suspension in a three stream, vertical microchannel [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109(9): 2316-2324.

[16] 楊云, 周新麗, 戴建軍, 等. 微流控線性加載低溫保護劑減少豬MⅡ期卵母細胞的滲透損傷 [J]. 生物化學與生物物理進展, 2016, 43(6): 616-623.

[17] Heo YS, Lee HJ, Hassell BA, et al. Controlled loading of cryoprotectants (CPAs) to oocyte with linear and complex CPA profiles on a microfluidic platform [J]. Lab on a Chip, 2011, 11(20): 3530-3537.

[18] Sahu PK, Golia A, Sen AK. Analytical, numerical and experimental investigations of mixing fluids in microchannel [J]. Microsystem Technologies, 2012, 18(6): 823-832.

[19] 張紹志, 王葳, 陳光明. 低溫保護劑加入/去除過程中細胞體積的極值 [J]. 生物數學學報, 2004, 19(4): 465-471.

[20] Mullen SF, Rosenbaum M, Critser JK. The effect of osmotic stress on the cell volume, metaphase II spindle and developmental potential of in vitro matured porcine oocytes [J]. Cryobiology, 2007, 54(3): 281-289.

[21] Wang Liang, Liu Jun, Zhou Guanbin, et al. Quantitative investigations on the effects of exposure durations to the combined cryoprotective agents on mouse oocyte vitrification procedures [J]. Biology of Reproduction, 2011, 85(5): 884-894.

[22] Wang Xin, Al-Naib A, Sun Dawen, et al. Membrane permeability characteristics of bovine oocytes and development of a step-wise cryoprotectant adding and diluting protocol [J]. Cryobiology, 2010, 61(1): 58-65.

[23] Song YS, Moon S, Hulli L, et al. Microfluidics for cryopreservation [J]. Lab on a Chip, 2009, 9(13): 1874-1881.

Experimental Study of Linear Removing Cryoprotective Agents from MII Porcine Oocytes with Microfluidics Device

Zhou Xinli1*Yang Yun1Dai Jianjun2Zhang Defu2Shao Wenqi1Yi Xingyue1Tao Leren1

1(InstituteofBiothermalTechnology,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)2(AnimalandVeterinaryResearchInstitute,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201106,China)

Cryoprotective agents (CPAs) must be removed from cryopreserved oocytes before used in clinic. Step-wise methods usually lead to the cell loss due to complicated operating steps, and may cause fatal osmotic injury to oocytes during CPAs removal process. In order to minimize the osmotic injury to oocytes, a microfluidic device for unloading CPAs from oocytes was designed and fabricated in this study. CPAs were linear unloaded from MII porcine oocytes with microfluidic device under different durations (6 min, 8 min and 10 min), the cell volume changes and the effects on the survival and developmental rate of oocytes were investigated, and then compared with that obtained by the conventional step-wise methods. Results showed that 8 min duration was optimal for linear unloading CPAs with microfluidic device. The linear method remarkably reduced the osmotic injury to oocytes during the removal of CPAs. The highest normalized swelling volume of oocyte only reached 1.12±0.07. The survival, cleavage and blastocyst rate of oocytes were 83.6%, 72.4% and 21.5%，respectively, which were significantly higher than those of one-step method and step-wise methods (P<0.05). In conclusion, linear unloading CPAs with the microfluidic method can significantly alleviate the osmotic damage to oocytes, which may provide a new path for oocyte cryopreservation.

microfluidics; mixing; oocyte; CPA; osmotic injury

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.008

2016-09-20， 錄用日期:2017-04-07

國家自然科學基金(51376132)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0442-07

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: zjulily@163.com