高效液相色譜梯度洗脫法測定八寶驚風散中鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量※

鐘 鳴 劉偉銳 楊占東 盧嘉頡 蔣兆健

高效液相色譜梯度洗脫法測定八寶驚風散中鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量※

鐘 鳴 劉偉銳 楊占東 盧嘉頡 蔣兆健

目的采用多波長高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法建立同時測定八寶驚風散中鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的方法。方法采用C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流速為0.7 ml/min；以乙腈-甲醇（1:4）為流動相A，以0.1%三乙胺溶液為流動相B，梯度洗脫；檢測波長：254nm，柱溫為30℃。結果鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別在5.10～102.00 μg/ml（r=0.9994）、5.95～119.00 μg/ml（r=0.9996）、6.10～122.00 μg/ml（r=0.999 9）、5.65～113.00 μg/ml（r=0.9998）時與其峰面積呈良好的線性關系；鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均加樣回收率分別為97.66%、96.72%、98.99%、99.16%，RSD（n=6）分別為 1.32%、0.52%、0.78%、1.56%。結論該方法是一種快速、靈敏、準確的分析方法，可作為八寶驚風散的含量控制方法。

八寶驚風散；鉤藤堿；異鉤藤堿；升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷

在我國衛生管理部門頒布的藥品標準中藥成方制劑（第20冊）中，八寶驚風散主要中藥成分有鉤藤、防風、天麻（制）、黃芩、天竺黃、全蝎（制）、沉香、丁香、冰片、茯苓、麝香、薄荷、川貝母、金礞石（煅）、膽南星、人工牛黃、珍珠、龍齒、梔子等19味，該制劑具有祛風化痰、退熱鎮驚的療效，是小兒驚風、發燒咳嗽、嘔吐痰涎等癥狀的臨床常用藥物[1-2]。八寶驚風散處方中主藥是鉤藤和防風，2012年衛生管理部門頒布的標準未對該方中相關物質含量進行量化規定，從而對該藥的制劑工藝研究和臨床用藥產生一定的阻礙，為有效控制其質量和藥效，本研究將通過高效液相色譜（HPLC）法對八寶驚風散中主藥有效成分鉤藤所含鉤藤堿、異鉤藤堿和防風所含升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷進行量化研究。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器1200型HPLC色譜儀采用Chemstation色譜工作站（購自美國安捷倫 Agilent科技公司）；VS-100UE型恒溫超聲波提取機（購自江蘇無錫沃信儀器有限公司）。

1.2 試驗試劑鉤藤堿對照品（批號：76-66-4，純度：98.0%）購于貴州迪大科技有限責任公司；異鉤藤堿對照品（批號：111927-201102，純度：100.0%）、升麻素苷（批號：111522-201310，純度：95.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：111523-201208，純度：96.4 %）均購于中國食品藥品檢定研究院；八寶驚風散（每瓶裝 0.26g；批號：140513、140514、140515）購于江西民濟藥業有限公司；流動相中三乙胺為分析純試劑（購自天津市富宇精細化工有限公司)；流動相甲醇、乙腈為色譜純試劑（購自天津市大茂化學試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件本實驗色譜柱采用大龍依利特 C18柱（規格為4.6 mm×200 mm，填料粒徑為5 μm）；參照已有文獻和預實驗，按比例乙腈-甲醇（1:4）混合為流動相 A，0.1%三乙胺溶液為流動相 B，采用梯度洗脫方法（0～10min，65.0%A；10～22 min，65.0%→50.0%A；22～45min，50.0%A→40.0%A；45～50 min，40.0%A→65.0%A）[3-7]；檢測波長254 nm[8-10]；每分鐘流量為0.7 ml；柱溫為30℃；每次進樣量20 μl。在此色譜條件下，所測處方中主要藥效成分與其他成分能達到較好的分離效果，按異鉤藤堿計理論塔板數≥3000，分離度≥2.0。

2.2 對照品溶液的配制依次分別稱取鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，置于4個20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別為0.510 mg/ml、0.595 mg/ml、0.610 mg/ml和0.565 mg/ml對照品溶液，配制完成儲存于4℃冰箱，備用。對上述對照品母液精密吸取1.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml分別置于 50 ml容量瓶，以甲醇進行補足至刻度，搖勻，即得鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷與 5-O-甲基維斯阿米醇苷質量濃度分別為 0.0153 mg/ml、0.0119 mg/ml、0.0244 mg/ml、0.0452 mg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取八寶驚風散適量，研細，取研細粉末10.0 g，并精密稱量，放入100 ml具塞三角錐形瓶，于電子分析天平中去皮歸零；另外精密量取50 ml甲醇加入錐形瓶，并記錄稱量值；將上述三角錐形瓶置于恒溫超聲波中（功率200 W，頻率20 kHz），超聲處理40 min；超聲結束將超聲液自然冷卻后，稱量整個三角錐形瓶重量，將缺失的甲醇進行補足，并搖勻；然后，用0.45 μm針式過濾器進行過濾，取其續濾液，即為本實驗的供試品溶液，保存備用。

2.4 陰性對照溶液的制備依據藥品標準中藥成方制劑（第20冊）中八寶驚風散處方中藥的組成比例，分別稱取無鉤藤的所有中藥 1份和無防風的所有中藥1份，分別按制劑工藝制備與八寶驚風散工藝一致的鉤藤空白樣品和防風空白樣品。制備后的空白樣品同上2.3項下的處理方法進行配液，制成鉤藤陰性對照溶液、防風陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗按 2.1項色譜條件，依次對八寶驚風散對照品溶液、供試品溶液、鉤藤陰性對照溶液和防風陰性對照溶液進樣，測定相應物質的含量。結果：供試品溶液中吸收峰的保留時間與對照品溶液中的鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷吸收峰對應一致，說明供試品溶液含有對應的物質；但鉤藤陰性對照溶液中未見鉤藤堿和異鉤藤堿色譜吸收峰；防風陰性對照溶液譜圖中未見升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷吸收峰（圖1）。

2.6 線性關系考察取5支10 ml容量瓶分別標號1-5號進行標注，另精密吸取已配制的對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml依次置于容量瓶，并用甲醇定容，搖勻。按 2.1項色譜條件進行分析測定，根據HPLC色譜圖中相應物質的峰面積A及其相應的質量濃度 C，得鉤藤堿回歸方程為：A=2.2086×104C+267.1，r=0.9994，線性范圍為 5.10～102.00 μg/ml；異鉤藤堿A=2.0685×104C－300.7，r=0.9996，線性范圍為 5.95～119.00 μg/ml；升麻素苷 A=5.5143×104C+404.5，r=0.9999，線性范圍為 6.10～122.00 μg/ml；5-O-甲基維斯阿米醇苷 A=6.3597×104C+511.6，r=0.9998，線性范圍為 5.65～113.00 μg/ml。結果表明：鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷均有相應的線性范圍，因此通過該方法進行測定的對照品物質具有良好的線性關系。

圖1 鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的HPLC

2.7 精密度試驗為考察儀器設備的精密度，精密量取2.2項中制備具的對照品溶液20 μl并按HPLC法進樣，按2.1項中色譜條件進行設定，通過峰面積計算各組分含量，重復上述操作共 6次，依據每次測定得到的峰面積計算4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標準偏差，其結果分別為0.83%、0.94%、0.55%和0.61%，因此該HPLC儀器設備具有良好的精密度。

2.8 重復性試驗為考察八寶驚風散測定方法的重現性的優劣，選取任意批號的八寶驚風散，稱取該批號藥品6份作為供試品，按2.3項處理方法進行配制，按2.1項色譜條件進行設定，依據每份供試品測定的峰面積計算 4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標準偏差，其結果分別為0.82%、0.64%、0.57%和0.42%，因此該測定方法具有良好的重現性。

2.9 穩定性試驗為考察八寶驚風散供試品溶液的穩定性，選取任意批號的八寶驚風散，稱取該批號藥品1份作為供試品，按2.3項處理方法進行配制，配制后的溶液放置于室溫條件中，分別在0、2、4、8、12、24 h時精密量取20 μl，按2.1項方法進行測定，依據不同時點測定的峰面積計算 4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標準偏差，其結果分別為 0.76%、0.88%、0.51%和0.49%，因此24 h內八寶驚風散供試品溶液具有良好的穩定性。

2.10 加樣回收率試驗稱取已知各主要成分含量的八寶驚風散（鉤藤堿為 0.079 mg/g、異鉤藤堿為0.063 mg/g、升麻素苷為0.121 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇苷為0.218 mg/g）適量，研細，精密稱取研細粉末5.0 g，放入100 ml具塞三角錐形瓶，于電子分析天平中去皮歸零；另外精密量取25 ml甲醇和25 ml已制備的對照品溶液加入該錐形瓶，并記錄稱量值；將上述三角錐形瓶放入恒溫超聲波中（功率200 W，頻率20 kHz），超聲處理40 min；超聲結束后將超聲液自然冷卻后，稱量整個三角錐形瓶重量，將缺失的甲醇補足，搖勻；然后，用0.45 μm針式過濾器進行過濾，取其續濾液，作為本實驗的加樣供試品試液，儲存備用。測定的色譜條件按2.1項方法進行設定，依據測定的峰面積計算各組分回收率，結果見表1。

2.11 樣品測定選取不同批號的八寶驚風散3份作為待測樣品，按2.3項方法進行待測溶液的配制，精密吸取待測樣品溶液20 μl并按HPLC方法進樣，按2.1項色譜條件進行設定，通過峰面積計算鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷組分含量，結果見表2。

3 討論

3.1 供試品制備提取時間的選擇，在試驗過程中分別對供試品制備時的超聲提取時間進行了對比研究，在超聲波（功率200 W，頻率20 kHz）條件下分別超聲處理20 min、40 min和60 min，對不同超聲時間進行考察。各時點超聲結果顯示，八寶驚風散各主要成分含量由高到底依次為60 min、40 min和20 min，且20 min含量明顯低于超聲提取40 min和60 min的含量，而超聲提取40 min與60 min含量差異不大，因此本測定方法采用超聲波（功率200 W，頻率20 kHz）條件下超聲提取40 min作為八寶驚風散供試品溶液的提取方法。

表1 鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷回收率試驗

表2 樣品含量測定結果(±s,n=3)

表2 樣品含量測定結果(±s,n=3)

批號 鉤藤堿(mg/g)異鉤藤堿(mg/g)升麻素苷(mg/g)5-O-甲基維斯阿米醇苷(mg/g)140513 0.079±0.001 0.063±0.001 0.121±0.001 0.218±0.002 140514 0.085±0.001 0.067±0.001 0.108±0.001 0.211±0.001 140515 0.081±0.001 0.061±0.001 0.127±0.001 0.227±0.002

3.2 本實驗還考察了不同流動相的梯度洗脫方法（甲醇-水、甲醇-0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.1%三乙胺溶液、乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液）對測定八寶驚風散各主要成分含量的影響，結果以乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液不同比例梯度洗脫分離度效果最佳，峰型對稱，各峰之間無重疊，故選取乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液作為流動相梯度洗脫。

3.3 鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝，具有息風定驚、清熱平肝的功效，可用于肝風內動、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇、頭痛眩暈等癥的治療；中藥防風具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，可用于感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢、破傷風等癥的治療。鉤藤堿和異鉤藤堿為鉤藤的主要成分，升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷為防風的主要成分，通過本研究的 HPLC測定方法，能快速、靈敏、準確測定八寶驚風散中的 4個主要成分，為八寶驚風散產品質量控制和量化臨床用藥提供可靠的方法。

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[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)[S].北京:2010:140,240,附錄30,附錄36.

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Determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San by HPLC

Zhong Ming Liu Weirui Yang Zhandong Lu Jiajie Jiang Zhaojian

ObjectiveTo develop an HPLC method for the simultaneous determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline, Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.MethodsThe chromatograhic separation was performed on C18column(4.6 mm×200 mm,5 μm),A linear elution of acetonitrilemethanol(1:4) and 0.1% triethylamine solution was adopted at the flow rate of 0.7 ml/min.The detection wavelength were 254 nm.The column temperature was 30℃.ResultsRhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside had good linearity at 5.10～102.00 μg/ml(r=0.9994)、5.95～119.00 μg/ml(r=0.9996)、6.10～122.00 μg/ml(r=0.9999)、5.65～113.00 μg/ml(r=0.9998),respectively.The average recoveries and RSD were 97.66%(1.32%),96.72%(0.52%), 98.99%(0.78%) and 99.16%(1.56%),respectively.Conclusion The method was simple,convenience and may be used in the determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.

Babao Jingfeng San;Rhyncholphylline;Isorhynchophylline;Prim-O-glucosylcimifugin;5-O-Methylvisammioside

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.08.010

廣州白云山漢方現代藥業有限公司，廣東廣州 510240

國家發展和改革委員會2011年國家工程研究中心創新能力建設項目（編號：發改辦高技[2011]1896號）

鐘鳴（1973.2-），碩士，制藥高級工程師。主要從事中藥/天然藥物的研究與開發工作。Email：gzmingzhong@126.com

蔣兆健（1968.3-），博士，主任藥師。主要從事新藥的研究與開發工作。Email：jzj100508@163.com