金葉紫穗槐組織培養(yǎng)研究

石進(jìn)朝++陳蘭芬++李彥俠

摘要：以金葉紫穗槐（Amorpha fruticosa ‘Jinye）為外植體，探討了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)對(duì)外植體分化、增殖和生根的影響。結(jié)果表明，①金葉紫穗槐組織培養(yǎng)最適宜的外植體是半木質(zhì)化帶芽莖段，以70%乙醇30 s+0.1%升汞（HgCl2）消毒4～5 min為最好，外植體發(fā)芽率可達(dá)66.7%～70.0%。②適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L。③生根試管苗適宜的開(kāi)瓶煉苗時(shí)間為2～3 d，在一年中的3～5月，選擇基徑≥0.3 mm的試管苗移栽到蛭石培養(yǎng)基上能夠獲得93.3%的成活率。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；外植體；增殖；生根；金葉紫穗槐（Amorpha fruticosa ‘Jinye）

中圖分類號(hào)：S793.203 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）16-3148-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.038

Tissue Culture of the Amorpha fruticosa ‘Jinye

SHI Jin-chao， CHEN Lan-fen， LI Yan-xia

（Beijing Agricultural Vocation College， Beijing 102442， China）

Abstract： Using Amorpha fruticosa ‘Jinye as explants， influences of different plant growth hormones on differentiation，multiplication and rooting were examined. The results showed that①the optimal explant material was tender stem with single bud，sterilized 30 s in 70% ethanol and 4～5 min in 0.1% HgCl2，the germination rate of explants was 66.7%～70.0%.②The optimal subculture was MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L，and rooting media was 1/2MS+IBA 0.5 mg/L.③the glass seedling rooting condign open the glass bottle hardened times was 2～3 d，than the diameter ≥0.3 mm glass seedling was transplanted on vermiculite，the survive rates of glass seedling were 93.3% in march and may of a year.

Key words： tissue culture； explant； proliferation； rooting； Amorpha fruticosa ‘Jinye

紫穗槐（Amorpha fruticosa L.）屬于蝶形花科（Papilionaceae）紫穗槐屬（Amorpha）多年生落葉叢生灌木，高達(dá)4 m，枝條直伸，樹(shù)皮暗灰色。喜光，耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿、較耐濕、適應(yīng)性強(qiáng)。根系發(fā)達(dá)，根部有根瘤菌，具有固氮能力。紫穗槐是城鄉(xiāng)綠化、水土保持、改良土壤的主要樹(shù)種之一[1-4]。金葉紫穗槐是2013年在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)的紫穗槐實(shí)生苗變種，為落葉叢生灌木。新梢金黃色，基部黃綠色，一年生冬枝深紫色。春芽金黃色，新展葉金黃色，老葉漸變綠。總狀花序頂生或枝端腋生，花軸密生黃色短柔毛，為北京地區(qū)一個(gè)良好的鄉(xiāng)土彩色觀賞樹(shù)種，鮮見(jiàn)金葉紫穗槐相關(guān)組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。為科學(xué)合理利用北京地區(qū)這一彩色植物新材料，2015年4月至2016年12月對(duì)金葉紫穗槐進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，培養(yǎng)金葉紫穗槐適宜的外植體材料，篩選適宜的分化及生根培養(yǎng)基及栽培基后，探索了煉苗栽培技術(shù)，為大規(guī)模快速繁殖金葉紫穗槐奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選取北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院院內(nèi)金葉紫穗槐（Amorpha fruticosa ‘Jinye）半木質(zhì)化莖段作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 適宜外植體消毒方法的篩選 2015年4月，從北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院彩林示范基地露地栽培的金葉紫穗槐上選取當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，截取帶芽莖段作為外植體，自來(lái)水沖洗1 h，洗滌靈水溶液清洗30 min。將外植體轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，70%乙醇清洗30 s，無(wú)菌水清洗1～2次，然后分別設(shè)置0.1%的升汞（HgCl2）消毒4、5、6、7 min，無(wú)菌水清洗5～6次。消毒后接種在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，每個(gè)處理30個(gè)帶芽莖段。

1.2.2 適宜增殖分化培養(yǎng)基的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA）及萘乙酸（NAA），對(duì)金葉紫穗槐組培苗進(jìn)行增殖，30 d后記錄接種處理后的苗木高度、增殖系數(shù)及生長(zhǎng)勢(shì)，確定金葉紫穗槐適宜的增殖分化培養(yǎng)基。

1.2.3 適宜生根培養(yǎng)基的篩選 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的吲哚丁酸（IBA）及萘乙酸（NAA），接種20 d后記錄各處理的試管苗生根情況，確定金葉紫穗槐適宜的生根培養(yǎng)基。

1.2.4 不同配比栽培基質(zhì)的篩選 將金葉紫穗槐生根苗移栽到不同配比的栽培基質(zhì)中，30 d后調(diào)查生根苗成活率和生長(zhǎng)勢(shì)，確定金葉紫穗槐生根苗移栽最適培養(yǎng)基。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體污染率的影響

2.1.1 不同消毒方法對(duì)外植體發(fā)芽率的影響 不同消毒方法對(duì)金葉紫穗槐外植體發(fā)芽率的影響見(jiàn)表1。由表1可以看出，4月從室外采集的半木質(zhì)金葉紫穗槐帶芽莖段進(jìn)行的8個(gè)處理消毒試驗(yàn)，0.1%升汞處理4～5 min時(shí)外植體污染率、殺死率、芽萌發(fā)率分別為53.3%～66.7%、0～10.0%、70.0%，以外植體芽萌發(fā)率最高為依據(jù)，單一0.1%升汞處理外植體的適宜時(shí)間為4～5 min。選擇用70%乙醇處理30 s，再用0.1%升汞處理4～7 min，結(jié)果表明，70%乙醇處理后，外植體污染率明顯降低，芽萌發(fā)率和外植體殺死率的影響不大。因此，在進(jìn)行金葉紫穗槐外植體消毒時(shí)，用70%乙醇處理30 s，再用0.1%升汞處理4～5 min，芽萌發(fā)率可達(dá)66.7%～70.0%。

2.1.2 適宜外植體采集時(shí)期篩選 分別在2月16日、4月18日、6月15日、8月20日、10月15日、12月16日采集金葉紫穗槐半木質(zhì)化帶芽莖段30個(gè)，按表1處理5、處理6對(duì)外植體消毒，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，1年中從不同月份采集的金葉紫穗槐外植體發(fā)芽率在41.1%～85.2%之間變化，4月采集的新萌發(fā)的半木質(zhì)化外植體污染率最低（26.7%），發(fā)芽率最高，達(dá)85.2%。外植體污染率由低到高的月份為4月、2月、12月、10月、6月、8月，發(fā)芽率由高到低的月份為4月、6月、10月、8月、12月、2月。夏季采集的污染率較高，主要是因?yàn)橄募緶囟雀撸瑵穸却螅s菌活躍。因此，在采集外植體時(shí)要盡量避開(kāi)夏季高溫高濕季節(jié)，綜合污染率和發(fā)芽率，在進(jìn)行金葉紫穗槐外植體采集時(shí)，以春季4～5月萌芽后采集半木質(zhì)化的帶芽莖段為宜。

2.2 適宜增殖培養(yǎng)基的篩選

在繼代30 d時(shí)，在增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA及NAA，依據(jù)增殖苗生長(zhǎng)高度、增殖系數(shù)、生長(zhǎng)勢(shì)3項(xiàng)指標(biāo)確定金葉紫穗槐適宜的增殖培養(yǎng)基，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，處理1～處理4雖然苗木高生長(zhǎng)量最大，叢生芽較多，增殖系數(shù)高（7.9～8.1），但長(zhǎng)勢(shì)弱；處理11、處理12苗木高生長(zhǎng)量最小，生長(zhǎng)勢(shì)緩慢，增殖系數(shù)低（2.1～2.6）。生長(zhǎng)素的濃度高，可以促進(jìn)苗木的高生長(zhǎng)，但苗木變得細(xì)弱。從增殖苗生長(zhǎng)高度及生長(zhǎng)勢(shì)綜合分析，適宜的增殖培養(yǎng)基為處理7（MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L），增殖系數(shù)可達(dá)6.9。

2.3 適宜生根培養(yǎng)基的篩選

在1/2MS生根培養(yǎng)基中加入不同濃度的IBA及NAA，生根培養(yǎng)20 d后，記錄6種生根培養(yǎng)基試管苗的開(kāi)始生根時(shí)間、生根數(shù)量、根長(zhǎng)度、根生長(zhǎng)勢(shì)4項(xiàng)指標(biāo)，依此確定適宜的IBA及NAA添加濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。綜合分析6種生根培養(yǎng)基在生根時(shí)間、生根數(shù)量、根生長(zhǎng)量及生長(zhǎng)勢(shì)的調(diào)查結(jié)果，處理4雖然開(kāi)始生根時(shí)間較短，為8 d，但有少量愈傷出現(xiàn)，不利于移栽成活；處理2開(kāi)始生根時(shí)間為10 d，平均根數(shù)5條，平均根長(zhǎng)為2.5 cm，為金葉紫穗槐試管苗生根最好。適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L。

2.4 金葉紫穗槐試管苗移植關(guān)鍵環(huán)節(jié)與成活率

2.4.1 在溫室的開(kāi)瓶煉苗天數(shù)與試管苗移栽成活率 試驗(yàn)中選取長(zhǎng)勢(shì)、根數(shù)、苗高等相對(duì)整齊的金葉紫穗槐瓶苗，設(shè)計(jì)在溫室中進(jìn)行瓶苗煉苗0、2～3 d及4～5 d后移栽，根據(jù)瓶苗移栽成活率，確定在溫室中進(jìn)行瓶苗煉苗的適宜天數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，直接從培養(yǎng)室出瓶，而不經(jīng)過(guò)溫室整瓶煉苗的金葉紫穗槐瓶苗的移栽成活率僅為66.7%，而打開(kāi)瓶口4～5 d，移栽成活率為60.0%，并且移栽出來(lái)的苗出現(xiàn)了長(zhǎng)菌現(xiàn)象，影響了瓶苗成活率。只有開(kāi)瓶2～3 d的試管苗移栽成活率最高，達(dá)96.7%。因此，開(kāi)瓶2～3 d后進(jìn)行金葉紫穗槐試管苗移栽能夠獲得較高的成活率。

2.4.2 金葉紫穗槐試管苗基徑與移栽成活率 將 <0.1 mm、0.1～0.3 mm及0.3～0.5 mm 3種規(guī)格基徑的金葉紫穗槐試管苗移植在蛭石中培養(yǎng)時(shí)，成活率見(jiàn)表6。由表6可以看出，金葉紫穗槐試管苗基徑與移栽成活率呈正相關(guān)。基徑為0.3～0.5 mm的金葉紫穗槐試管苗移栽后，不僅生長(zhǎng)快，而且有大量根毛生長(zhǎng)。選用基徑為<0.1 mm的金葉紫穗槐試管苗移栽后，生長(zhǎng)慢，緩苗期長(zhǎng)，成活率低，根毛少。因此，在進(jìn)行金葉紫穗槐試管苗移栽時(shí)，選用基徑≥0.3 mm的金葉紫穗槐試管苗能夠獲得93.3%的成活率。

2.4.3 移栽基質(zhì)與金葉紫穗槐試管苗移栽成活率 將金葉紫穗槐試管苗移栽到不同基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)，成活率見(jiàn)表7。由表7可以看出，金葉紫穗槐生根苗移栽到保水、透氣性好的蛭石上，成活率在90.0%以上，移栽到透氣性較差的河沙與腐殖質(zhì)土混合物（3∶1）中，成活率僅為63.3%。因此，移栽金葉紫穗槐試管苗時(shí)，選擇蛭石作培養(yǎng)基質(zhì)較好。

試管苗移栽成活率受多種因素影響。從試管苗基莖、移栽基質(zhì)等方面進(jìn)行的研究表明，試管苗越粗壯，木質(zhì)化程度越高，移栽成活率越高，根系生長(zhǎng)越好。在溫室中對(duì)瓶苗進(jìn)行煉苗時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)試管苗移栽成活率的影響也很大。移栽前整瓶煉苗可使苗木粗壯，增強(qiáng)對(duì)水分脅迫和病害的抗性，能夠提高移栽成活率。

2.4.4 移栽時(shí)期與金葉紫穗槐試管苗移栽成活率 將金葉紫穗槐試管苗在不同季節(jié)進(jìn)行移栽，成活率見(jiàn)表8。由表8可以看出，金葉紫穗槐試管苗移植成活率最高在3月，7月移植時(shí)成活率最低。3月氣溫逐漸回升，到5月，日光溫室中的溫度很容易控制在20～25 ℃，適于試管苗生長(zhǎng)。隨著氣溫升高，到7月達(dá)到一年中的最高溫度30 ℃左右。因此，在一年中的3～5月為金葉紫穗槐試管苗移植的最佳時(shí)期。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

金葉紫穗槐組織培養(yǎng)時(shí)，適宜的外植體材料為當(dāng)年生木質(zhì)化或半木質(zhì)化帶芽枝段作為外植體，誘導(dǎo)出不定芽的發(fā)生。適于金葉紫穗槐外植體消毒方法是用70%乙醇處理30 s，再用0.1%升汞處理4～5 min，外植體發(fā)芽率最高可達(dá)66.7%～70.0%。采集外植體的適宜時(shí)間為春季萌芽前。適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L。適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L。endprint

3.2 討論

關(guān)于外植體選擇問(wèn)題，李衛(wèi)等[5]以子葉節(jié)為外植體直接分化芽，建立了紫穗槐的快速離體繁殖技術(shù)，分化率為100%，增殖率為5.21；管清杰等[6]以紫穗槐不帶芽莖段為研究對(duì)象，以愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化，實(shí)現(xiàn)了100%的誘導(dǎo)率和96.2%的分化率。對(duì)于組織培養(yǎng)生根困難的樹(shù)種如杜仲（Eucommia ulmoides）等選用半木質(zhì)化的帶芽莖段組培獲得成功[7，8]。本研究以半木質(zhì)化金葉紫穗槐帶芽莖段做外植體，誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，分化率為100%，增殖系數(shù)為6.8。試驗(yàn)曾選用木質(zhì)化的金葉紫穗槐帶芽莖段作為外植體，能夠誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，但污染率比較高，達(dá)68.2%。因此，選擇金葉紫穗槐外植體時(shí)，先把未發(fā)芽的金葉紫穗槐枝段在室內(nèi)進(jìn)行水培培養(yǎng)或扦插，當(dāng)萌發(fā)枝高15～20 cm時(shí)，采集帶芽萌發(fā)枝作為外植體，能夠獲得90%以上的萌發(fā)率，污染率降低到27%以下，這與長(zhǎng)綠期金銀木組織培養(yǎng)繁育外植體的選擇相似[9]。

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