緩激肽對體外培養大鼠血視網膜屏障通透性的影響

蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 梁 軍 閆 磊

(牡丹江醫學院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

緩激肽對體外培養大鼠血視網膜屏障通透性的影響

蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 梁 軍 閆 磊

(牡丹江醫學院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

目的探討緩激肽對體外培養大鼠血視網膜屏障通透性的影響。方法將緩激肽作用于Transwell小室建立體外培養的大鼠視網膜血管內皮細胞(REVC)間緊密連接屏障模型，通過跨上皮細胞電阻(TER)值觀察緩激肽對大鼠REVC間緊密連接結構的影響；RT-PCR 法檢測緊密連接相關蛋白ZO-1和occludin mRNA表達水平的變化。結果實驗組作用2 h的TER值小于測量前、作用4 h組和對照組(P<0.01)；實驗組作用4 h組和測量前、對照組TER值無明顯變化(P>0.05)。結論緩激肽可在轉錄水平上減少緊密連接相關蛋白ZO-1和occludin mRNA表達，能夠開放大鼠REVC間的緊密連接，增加血視網膜屏障的通透性。

緩激肽；視網膜血管內皮細胞；緊密鏈接

血視網膜屏障是機體維持眼內環境穩定的重要結構之一，可以選擇性濾過血液中的有用物質。這種功能在維持眼內環境穩定的同時，也限制藥物向眼內組織傳遞，從而嚴重影響療效。血視網膜屏障也是藥物治療糖尿病所致視網膜病變、視網膜動靜脈阻塞等眼底疾病的主要制約因素。視網膜血管內皮細胞(REVC)在各種眼底病發病中都起著關鍵作用，本研究利用Transwell小室建立體外培養的大鼠REVC間緊密連接屏障模型，觀察緩激肽對大鼠血視網膜屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF 級大鼠30只，質量80～110 g，雌雄不限(牡丹江醫學院實驗動物中心提供)。DMEM/F12培養基、D-Hank液(美國Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；第Ⅷ因子相關抗原抗體(美國Sigma公司)；24孔板Transwell小室，膜孔徑0.4 μm(美國Millipore公司)，Millicell-ERS 電阻測量儀(美國Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠REVC的獲取和細胞培養 取SPF級大鼠1只，過量麻醉處死，無菌下在赤道部剪開眼球，去除眼前節及玻璃體，用眼科剪小心分離視網膜，用2%胰蛋白酶室溫消化視網膜30 min,邊消化邊吹打視網膜,取出殘留的視網膜,除去可見的大血管后剪碎、勻漿,濾網過濾(孔徑100 μm),用0.1%Ⅱ型膠原酶消化30 min,加入含有體積分數20%的胎牛血清DMEM/F12培養液終止消化，1 000 r/min離心10 min，收集細胞。加入含有體積分數10%的胎牛血清DMEM/F12培養液，滴加重組牛堿性成纖維細胞生長因子，置于5%CO2自動調節保溫箱培養(37℃)，每2～3 d換液，不斷洗去崩解的視網膜碎片及死亡的其他細胞,待細胞匯合單細胞層后,按1∶2傳代。

1.2.2大鼠REVC的鑒定 將蓋玻片放入培養瓶內消化細胞，37℃孵育24 h，待細胞爬滿后取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，用冷丙酮固定10 min，PBS漂洗細胞，加入第Ⅷ 因子相關抗原抗體，另外細胞加入PBS作陰性對照，37℃孵育1 h，用PBS漂洗3次，卵白素-生物素-酶復合物(SABC)法染色，二氨基聯苯胺(DAB)/H2O2顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.3體外培養的大鼠REVC間緊密連接屏障模型的建立 取培養的大鼠REVC經2.5 g/L胰酶消化后，以5×104個/ml的細胞密度接種于鋪有層黏連蛋白的Transwell小室中，上室加入400 μl細胞懸液，下室加入600 μl培養液，接種后第1天及之后每周換液2次，所用培養液為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液。

1.2.4緩激肽對體外培養的大鼠REVC間緊密連接屏障模型的影響 將在Transwell小室中培養15 d以后的大鼠REVC作為實驗對象。實驗分為實驗組和對照組；加入含緩激肽的DMEM/F12培養液，使緩激肽作用時間分別為2 h和4 h。作用相應時間后，用跨上皮細胞電阻測定儀(EVOM)測定跨上皮細胞電阻(TER)值，單位為Ω×cm2，最終測量值為膜連同大鼠REVC的電阻值減去背景電阻值，每一孔電阻的測量至少重復3次，每一時間點至少用不同的3個孔進行測量。

1.2.5RT-PCR 法檢測緊密連接相關蛋白occludin 和ZO-1 mRNA的表達 設計引物，ZO-1上游引物：5'-TGCTATTACACGGTCCTC-3'，下游引物5'-TGGTGCTCCTAAACAATC-3'，擴增長度為191 bp。occludin上游引物：5'-GACCACTATGAAACCGACTA-3'，下游引物：5'-CTCACTTCTCCAGCAACC-3'，擴增長度為411 bp。β-actin上游引物：5'-AGCCATGTACGTTAGCCATCC-3'，下游引物:5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，產物228 bp。分別對兩組采用Trizol試劑一步法提取細胞RNA，逆轉錄合成cDNA，進行PCR 擴增。PCR 反應參數：94℃ 5 min，94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，共31個循環，72℃延伸5 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照，用Bio-Rad 凝膠成像儀成像，用凝膠成像分析系統觀察并分析結果。以β-actin為內參照行半定量分析。相對含量測定：用美國 Bio-Rad Gep doc 2000 凝聚膠成像分析系統對電泳條帶進行灰度掃描并用Quantity One軟件計算ZO-1/β-actin、occludin/β-actin的比值表示其相對含量。

1.3統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1大鼠REVC的原代培養形態 倒置相差顯微鏡下觀察原代培養的大鼠REVC生長情況。分離的大鼠REVC一般在24 h后貼壁,逐漸形成細胞團,細胞呈梭形,第3～5天細胞克隆樣生長。12～15 d可呈鋪路石狀鋪滿培養皿成單層融合,存在明顯的接觸抑制。傳代細胞生長活躍，5～7 d即可融合生長。見圖1。

2.2大鼠REVC的免疫組化鑒定 大鼠REVC對Ⅷ因子相關抗體染色陽性，空白對照組則呈陰性。見圖2。

圖1 大鼠REVC原代培養24 h倒置顯微鏡下改變

圖2 大鼠REVC對Ⅷ因子相關抗體染色陽性改變

2.3緩激肽對體外培養大鼠REVC間緊密連接屏障模型的影響 加入緩激肽的大鼠REVC間緊密連接屏障模型不同時間點的TER值差異有統計學意義(F=21.25，P<0.01)，實驗組作用2 h的TER值(170.61±2.51)小于測量前(310.29±1.53)、4 h(298.35±2.86)和對照組(觀量前300.16±5.19，作用2 h 298.34±5.88，作用4 h 300.34±5.43)(P<0.01)；實驗組作用4 h、測量前和對照組無明顯變化(P>0.05)。

2.4RT-PCR 法檢測緩激肽對緊密連接相關蛋白ZO-1和occludin mRNA表達的影響 見圖3，表1。實驗組作用2 h,ZO-1和occludin mRNA值小于測量前、4 h和對照組(P<0.01)；實驗組作用4 h、測量前和對照組無明顯變化(P>0.05)。

圖3 RT-PCR檢測ZO-1和occludin mRNA表達

表1 緩激肽對ZO-1和occludin mRNA表達的影響(±s,n=10)

與實驗組2 h比較：1)P<0.01

3 討 論

血視網膜屏障由相鄰的REVC之間的緊密連接、周膜細胞及其之間的基膜組成，星形膠質細胞及Müller細胞的突起包繞其外，緊密連接是維持血視網膜屏障完整的基礎〔1〕。緩激肽是自然存在于體內的小分子九肽，是激肽釋放酶-激肽系統中一種主要的激肽類物質，既可引起病理生理反應，又可發揮生理保護作用，參與多系統器官的功能調節和病理生理過程，如心血管、腎臟、中樞神經系統的調節，葡萄糖代謝、細胞增殖、平滑肌收縮、炎癥、疼痛、休克和組織損傷過程〔2〕。目前，緩激肽開放屏障的功能已經成為新的研究熱點。Inamura等〔3〕在1994年首先發現小劑量緩激肽可以選擇性開放血腫瘤屏障。劉麗波等〔4〕發現緩激肽可以開放腦膠質瘤大鼠血腫瘤屏障的緊密連接，增加血腫瘤屏障的通透性。王玉勤等〔5〕發現小劑量緩激肽可以通過開放緊密連接增加大鼠缺血區血腦屏障的通透性。Easton等〔6〕研究表明緩激肽可通過B2受體結合，引起Ca2+釋放增加，從而激活磷脂酶A2和5-脂氧化酶，促進花生四烯酸的代謝，降低跨內皮細胞阻抗，開放血腦屏障的緊密連接。

目前針對緩激肽是否可以開放血視網膜屏障的研究還未見報道。本研究發現，給予緩激肽后，緊密連接相關蛋白ZO-1和occludin mRNA表達減少，大鼠血視網膜屏障的通透性升高，證明緩激肽具有開放血視網膜屏障的功能。緩激肽開放血視網膜屏障的機制還不明確。緊密連接在結構上是一組蛋白原件構成的復合體，主要包括：①跨膜蛋白，主要由occludins，claudins，junction associated molecules等蛋白家族組成；②胞質附屬蛋白，主要包括ZO-1，ZO-2，ZO-3，7H6等蛋白家族。細胞骨架蛋白F-actin是緊密連接形成胞旁屏障的重要因素，其幾乎存在于每一處緊密連接的細胞膜上，用細胞松弛素破壞細胞骨架蛋白F-actin 亦可導致緊密連接的破壞。ZO-1是1986年發現的與緊密連接相關的蛋白，是構成緊密連接的重要成分之一,能與其同源體ZO-2、ZO-3一起,為緊密連接的許多跨膜蛋白和細胞質緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺〔6〕。occludin是第一個被分離出來的緊密連接跨膜蛋白，由504個氨基酸殘基組成，相對分子質量為6.5×104。occludin中長的C端富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基與ZO-1的PDZ結構域相連，依次和肌動蛋白骨架細胞相連。緊密連接相關蛋白彼此之間存在相互作用，維持緊密連接的完整性。而且，如果這些蛋白發生紊亂將會直接影響緊密連接的完整性，進而改變屏障的通透性。劉坤〔7〕發現緩激肽與罌粟堿伍用可以通過減少緊密連接相關蛋白claudin-5表達，增加血腫瘤屏障的通透性。劉麗波等〔8〕發現緩激肽可在轉錄水平上減少緊密連接相關蛋白occludin 和ZO-1 的表達，開放血腫瘤屏障。血視網膜屏障的超微結構與血腦屏障和血腫瘤屏障具有一定的相似性。因此認為，緩激肽開放血視網膜屏障、增加血視網膜屏障的通透性的機制，可能與在轉錄水平上減少緊密連接相關蛋白ZO-1和occludin mRNA的表達水平、降低緊密連接相關蛋白occludin和ZO-1的表達有關。

1宋昊剛，崔 浩.血-眼屏障的作用及意義〔J〕.航空航天醫學,2005;16(2):53-4.

2Ongali B，Hellal F，Rodi D，etal.Autoradiographic analysis of mouse brain kinin B1 and B2 receptors after closed head trauma and ability of Anatibant mesylate to cross the blood-brain barrier〔J〕.J Neurotrauma,2006;23(5):696-707.

3Inamura T，Black KL.Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,1994;14(5):862-70.

4劉麗波，楊智舫，劉 麗，等.緩激肽對腦膠質瘤大鼠緊密連接影響的形態學觀察〔J〕.解剖科學進展，2007;13(3):226-9.

5王玉勤，安 平，薛一雪.緩激肽對大鼠缺血區血腦屏障的影響〔J〕.解剖科學進展，2005;11(2):95-8.

6Easton AS，Abbott NJ.Bradykinin increases permeability by calcium and 5-lipoxygenase in the ECV304/C6 cell culture model of the blood-brain barrier〔J〕.Brain Res,2002;953(2):157-69.

7劉 坤.緊密連接相關蛋白claudin-5在緩激肽與罌粟堿伍用開放血腫瘤屏障中的作用〔D〕.沈陽：中國醫科大學,2008.

8劉麗波，薛一雪，王 萍.緩激肽對腦膠質瘤大鼠occludin和ZO-1 mRNA的調節和機制〔J〕.中國醫科大學學報，2010;39(7):497-500.

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

黑龍江省自然科學基金資助項目(No.H2015078)

閆 磊(1978-)，男，講師，主要從事干細胞增殖與分化研究。

蔡克瑞(1980-)，女，講師，主要從事衰老生物機制及中藥抗衰老研究。

R329.2；R774.1

A

1005-9202(2017)16-3925-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.007