疝出型和退變突出型腰椎間盤組織中白細胞介素-17表達及與Modic改變的病理機制

孟志強 吳若丹 白云鶴 周三國

(焦作市人民醫院骨科，河南 焦作 454000)

疝出型和退變突出型腰椎間盤組織中白細胞介素-17表達及與Modic改變的病理機制

孟志強 吳若丹 白云鶴 周三國

(焦作市人民醫院骨科，河南 焦作 454000)

目的探討白細胞介素(IL)-17在疝出型和退變突出型腰椎間盤組織中表達的差異及Modic改變與突出類型的相關性和病理機制。方法確診并行手術治療的單節段腰椎間盤突出患者62例，根據椎間盤突出類型分為損傷疝出組41例和退變突出組21例。根據磁共振成像(MRI)將病例分為 Modic改變組22例和非Modic改變組40例。術中取椎間盤標本，采用蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化染色、SYBR green法熒光定量PCR觀察并檢測椎間盤組織病理改變和IL-17表達情況。結果損傷疝出組新生血管化發生率明顯高于退變突出組(P<0.01)。退變突出組IL-17陽性細胞數明顯低于損傷疝出組(P<0.01)。損傷疝出組椎間盤組織中IL-17 mRNA表達量明顯高于退變突出組(P<0.01)。Modic改變組椎間盤組織中IL-17 mRNA表達量明顯高于非Modic改變組(P<0.01)。疝出型IL-17 mRNA表達量與Modic改變之間存在明顯相關性(R=0.61，P<0.001)。結論損傷疝出型腰椎間盤髓核組織中存在明顯的局部炎性反應；IL-17在損傷疝出型椎間盤表達明顯，提示介導了椎間盤神經根微環境的免疫炎癥變化；自身免疫反應參與了Modic改變的病理機制。

椎間盤移位；腰椎；白細胞介素-17；Modic改變

腰椎間盤突出是坐骨神經痛的主要原因，多發于中老年人群，其病理機制尚未明確，損傷疝出椎間盤和退變突出椎間盤是否為同一病變過程的不同階段，還是兩個獨立的病理過程仍存在爭議。針對于腰椎間盤突出病因的研究包括炎性反應、機械負荷、營養、免疫學、遺傳學等，其中關于炎性反應和免疫學的研究較為廣泛〔1〕。相關研究發現，腰椎間盤退變性疾病患者磁共振成像(MRI)表現為終板及其下骨質信號改變，稱為Modic改變，其與腰腿痛相關，病理基礎被認為是一個炎性改變過程，但未能就病因進行深入研究〔2，3〕。輔助型T細胞(Th)17細胞和白細胞介素(IL)-17是近年來免疫學領域一個研究熱點，宿主防御、自身免疫性疾病的發病過程中Th-17細胞和IL-17軸起到關鍵作用，特別是類風濕關節炎、血管炎、銀屑病等自身免疫性疾病。本次研究通過觀察IL-17在疝出型和退變突出型腰椎間盤突出患者病變組織中的表達情況，探討自身免疫學因素在腰椎間盤突出病理機制中的作用及Modic改變可能的免疫學原因。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取焦作市人民醫院2015年1～12月確診并行手術治療的單節段腰椎間盤突出患者62例。篩選標準：①臨床癥狀結合影像學檢查確診為腰椎間盤突出；②病情嚴重且反復發作，經3個月保守治療仍持續進展，需手術治療；③影像學檢查結合術中觀察為疝出型和退變突出型。其中男43例，女19例；年齡53～72〔平均(65.39±6.05)〕歲。根據椎間盤突出類型分為損傷疝出組41例和退變突出組21例。收集全部患者的MRI檢查資料，根據病變節段椎體是否有Modic改變分為Modic改變組22例：再根據突出節段相鄰椎體終板及下方骨質在MRI上的信號改變，分為3個亞組，Ⅰ型改變組10例：T1加權像呈低信號，T2呈高信號；Ⅱ型改變組12例：T1加權像呈高信號，T2正常或略微升高。非Modic改變組40例：終板無Modic改變，僅腰椎間盤突出或疝出。

1.2方法

1.2.1主要儀器、試劑 KD-2950型恒溫切片機(北京萊博聯泰科技有限公司)；光學顯微鏡和攝像系統(日本OLYMPUS公司)；逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(亞太恒信生物科技有限公司)；Z 513K型高速離心機(賀默儀器科技有限公司)；PRISM 7900型高通量熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)；兔抗人多克隆IL-17抗體(上海信裕生物科技有限公司)；Tris溶液、免疫組化試劑盒(上海起福生物科技有限公司)。

1.2.2標本獲取及處理 疝出型腰椎間盤突出術中取游離的椎間盤，或切開后縱韌帶之后用髓核鉗取游離的椎間盤組織；退變突出型腰椎間盤突出在行腰椎后路減壓術后牽開神經，切開后縱韌帶，將部分蛻變的髓核和纖維環組織切除。取出標本后，將其中一半標本用10%甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋，4 μm連續切片。每個標本分別取3個切片行蘇木素-伊紅(HE)染色、甲苯胺藍染色、IL-17免疫組化染色；另外一半標本立即放入液氮中保存，行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3HE和IL-17免疫組化染色 常規步驟行組織切片HE染色，置于光學顯微鏡下觀察組織結構的形態特點，比較各組組織分布和細胞浸潤情況。常規SP法行免疫組化染色，設置陰性對照組，加入兔抗人多克隆IL-17抗體，黃色顆粒為陽性。高倍鏡視野下，隨機選取5個不同視野，觀察陽性細胞數。

1.2.4SYBR green法熒光定量PCR RT-PCR反應體系20 μl，包括cDNA模板1 μl、SYBR green PCR mix 12 μl、ddH2O 5 μl、引物2 μl。IL-17引物的正義序列：5′CACCTAGGGTTTTCCAGGAC3′，反義序列：5′GGAGACTCTAACATTCCATG3′。常規反應調節下共40個循環。使用NoePrimer 3.0 Demo軟件計算Ct值，相對定量法分析數據，即2-△△Ct值計算目的基因表達水平。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件行t檢驗或χ2檢驗及Pearson相關分析。

2 結 果

2.1HE染色結果 損傷疝出組可見纖維軟骨基質退變，周圍存在肉芽組織和新生血管；退變突出組可見纖維軟骨基質退變，無新生血管化、炎性細胞和肉芽組織(圖1)。損傷疝出組標本中有37例(90.24%)存在新生血管，明顯高于退變突出組〔3例(14.29%)，P<0.01〕。

圖1 兩組標本HE染色結果(×200)

2.2IL-17免疫組化染色結果 退變突出組患者椎間盤組織中存在少量散布的陽性細胞；損傷疝出組患者椎間盤組織中存在較多的IL-17陽性細胞(圖2)。按每一視野0.02 mm2，測得退變突出組陽性細胞均數為(2.3±1.0)個，明顯低于損傷疝出組的〔(7.6±2.2)個，P<0.01〕。

圖2 兩組標本IL-17免疫組化染色(×400)

非Modic改變組椎間盤組織中存在少量的陽性細胞；Modic改變組椎間盤組織中存在較多的IL-17免疫陽性細胞(圖3)。按每一視野0.02 mm2，測得Modic改變組陽性細胞均數為(8.2±3.4)個，明顯高于非Modic組的〔(3.4±0.8)個，P<0.01〕。

2.3SYBR green法熒光定量PCR結果 損傷疝出組椎間盤組織中IL-17 mRNA表達量為3.814±1.538，明顯高于退變突出組的(1.958±0.439，P<0.01)。Modic改變組椎間盤組織中IL-17 mRNA表達量為3.394±1.670，明顯高于非Modic改變組的(1.381±0.013，P<0.01)。

2.4損傷疝出型腰椎間盤突出與Modic改變相關性分析 Pearson相關性分析顯示，疝出型組IL-17 mRNA表達量與Modic改變之間存在明顯相關性(R=0.61，P<0.001)。見圖4。

圖3 兩組標本IL-17免疫組化染色(×400)

圖4 疝出型IL-17 mRNA表達量與Modic改變的線性關系

3 討 論

成年人椎間盤組織中血運基本消失，隨著年齡增長逐漸退變，會導致纖維環破裂，椎間盤抗原成分與體內免疫系統相互結合后產生免疫應答，誘發相鄰神經根部的慢性炎癥反應。研究顯示，腰椎間盤組織中膠原蛋白的抗原性強于纖維環的纖維蛋白；且髓核在機體免疫系統中暴露后IL-4分泌量明顯增高，γ干擾素(IFN)-γ分泌量明顯降低〔4〕，說明髓核在免疫系統暴露后可激活Th細胞分化為Th2細胞，進而分泌出IL-4。IL-17是另一個與慢性炎癥反應密切相關的免疫因子，但關于椎間盤組織中IL-17表達水平的研究仍較少見〔5〕。目前，公認的腰椎間盤突出的病理分型為損傷疝出型和退變突出型，該分類主要依據解剖學結構差異，但相關研究者發現其在發病機制上也存在差異〔6,7〕。

本研究顯示，IL-17參與椎間盤蛻變過程，而其在損傷疝出型中表達水平較高，可提示IL-17介導椎間盤神經根部微環境的自身免疫炎癥變化。腰椎間盤突出患者常合并影像學上的Modic改變，可分為Ⅰ型(炎癥期)、Ⅱ型(脂肪期)、Ⅲ型(骨質硬化期)。本研究顯示，自身免疫因素參與了椎間盤突出的病理過程；同時，損傷疝出型與Modic改變之間呈明顯關聯，說明損傷疝出型椎間盤病變與自身免疫因素密切相關。

本研究發現，退變突出型椎間盤組織中存在一定量的IL-17表達，若按椎間盤突出方向可將腰椎間盤突出分為向前突出、向后突出、向上和向下突出；當椎間盤組織向上和向下突出時可刺破椎體終板，椎體組織中的血液可接觸體內抗原組織，誘發自身免疫反應，進而使Th17細胞分泌IL-17。

1Tazawa T,Kamiya Y,Takamori M,etal.Relationship between ventral lumbar disc protrusion and contrast medium leakage during sympathetic nerve block〔J〕.J Anesth,2015;29(1):138-42.

2鄭啟新,鄒枕瑋,郭曉東,等.腰椎間盤退變性疾病的研究進展及展望〔J〕.中華實驗外科雜志,2010;27(11):1573-6.

3Zhang C,Xue Y,Wang P,etal.Foot drop caused by single-level disc protrusion between T10 and L1〔J〕.Spine,2014;38(26):2295-301.

4范 義,張宏光,高天俊,等.MR和DWI對腰椎間盤感染診斷價值的實驗研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2015;16(1):51-3.

5Bartynski WS,Rothfus WE.Peripheral disc margin shape and internal disc derangement:Imaging correlation in significantly painful discs identified at provocation lumbar discography〔J〕.Interv Neuroradi,2012;18(2):227-41.

6Zhu H,Zhou XZ,Cheng MH,etal.The efficacy of coblation nucleoplasty for protrusion of lumbar intervertebral disc at a two-year follow-up〔J〕.Int Orthop,2011;35(11):1677-82.

7張 威.多種炎性因子在椎間盤突出的炎癥機制中的作用研究進展〔J〕.醫學綜述,2013;19(20):3685-8.

〔2016-09-13修回〕

(編輯 袁左鳴)

河南省重點科技攻關基金資助項目(No.1321023104)

孟志強(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事骨科臨床及基礎研究。

R68

A

1005-9202(2017)16-4043-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.061