正交試驗法優選慈竹筍總黃酮提取工藝

胡 霞，陳小美，廖 琀，尹 鵬，廖 媛

（樂山師范學院 a.竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室；b.生命科學學院，四川 樂山 614000）

正交試驗法優選慈竹筍總黃酮提取工藝

胡 霞a，b，陳小美b，廖 琀b，尹 鵬a，b，廖 媛b

（樂山師范學院 a.竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室；b.生命科學學院，四川 樂山 614000）

為了優選慈竹筍總黃酮的提取工藝，對其藥用價值研究提供技術參考，文章以總黃酮含量為指標，乙醇體積分數、提取溫度、提取時間為考察因素，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優選出慈竹筍總黃酮的最佳提取工藝。結果顯示，在提取溫度（80℃）、乙醇體積分數（60%）、提取時間（1.5 h）時，慈竹筍的總黃酮含量最高，為32.24mg/g。經極差分析可知，影響慈竹筍總黃酮提取效果的因素順序為：提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間。

慈竹筍；總黃酮；正交試驗

0 引言

黃酮類化合物廣泛存在于自然界大多數的植物體中，不僅可抗炎、抗氧化、抗病毒，還能用于改善心腦血管疾病。作為強抗氧化劑，其對細胞抗衰老和退化有著很好的效果，因此被廣泛應用于女性化妝品行業中。然而，黃酮類化合物無法在人體內合成，只能通過食物獲取，因此人們一直都很重視從植物中提取黃酮類化合物[1-5]。中國是竹資源最豐富的國家，竹林面積達520萬hm2，占世界竹林總面積近1/4。開展竹類黃酮的提取研究，既可充分開發其藥用價值，也可增加黃酮類化合物的市場供應量。近年來，有不少學者以竹為材料對黃酮類化合物的提取工藝進行了研究，但大部分研究是針對竹葉進行，其中包括蘇春花、王福升等人采用乙醇萃取的方法進行長節箬竹葉總黃酮提取工藝研究，結果顯示長節箬竹葉黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分數85%，提取溫度85℃，竹葉質量與85%乙醇體積的比為1∶20（g/mL），提取時間 50min，在此優化的工藝條件下，長節箬竹竹葉總黃酮含量為2.23%[6]；蔣劍波等采用浸提-回流法對湘西慈竹葉總黃酮的提取進行了研究，結果表明湘西慈竹葉黃酮類化合物的優化提取條件為固定料液比1∶20，75%的丙酮為浸提劑，于70℃下回流加熱4 h，在此優化提取條件下，測得湘西慈竹葉總黃酮含量為 13.0mg.g-1(春)～12.4mg.g-1(秋)，春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉[7]；賈可敬，李湘洲等人采用4因素3水平正交試驗法對長沙青皮竹竹葉中黃酮的提取工藝條件進行了優化試驗，結果表明提取長沙青皮竹竹葉黃酮的最優條件為乙醇體積分數70%，固液比為 1∶25（g∶mL），提取 3次，每次提取時間為1.5 h，在此工藝條件下，長沙青皮竹葉中黃酮的提取率為1.85%[8]。關于竹筍總黃酮的研究只見毛竹筍有相關報道[9]，研究結果表明，采用乙醇熱回流提取法效果最好，總黃酮得率最高，為1.063%；影響毛竹筍總黃酮得率的因素順序依次為：固液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數。其最佳提取條件為：固液比(1:40)、提取溫度(60℃)、乙醇體積分數(70%)、提取時間(2.0 h)。

慈竹筍，又稱“慈筍”“八月筍”，為禾本科植物慈竹的嫩芽，是夏季時令筍蔬之一。慈竹主要分布在中國西南地區，為竹子的主栽品種，僅四川慈竹林面積就達1200萬畝。對其黃酮含量及提取工藝的研究未見報道。本文以總黃酮含量為指標，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優選出慈竹筍總黃酮的提取工藝，為慈竹資源的開發和利用提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

將新鮮的慈竹筍清洗干凈，烘干搗碎，過60目分目篩備用。

主要試劑：蘆丁標準品(0.25㎎/ml)、亞硝酸鈉（5%）、氫氧化鈉（4%）、硝酸鋁（10%）、無水乙醇(分析純)。主要儀器設備：HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、GZX-GF-101-2-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱、BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司)、TDZ5-WS多管架自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、T6新悅可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 標準曲線繪制

按照梁梓和尹鵬的方法繪制標準曲線[10-11]。

1.3 慈竹筍總黃酮含量測定

準確稱取慈竹筍樣品（1 g）于離心管(50mL)中，然后加入乙醇提取劑(40mL)，經不同乙醇體積分數、不同提取溫度、不同提取時間處理后，進行離心，離心要求為：速度4000 r/min、離心10min。隨后取出，吸取上清液1.0mL于25mL具塞比色管中，先加入對應的乙醇提取劑5mL以及1.0mL的亞硝酸鈉溶液(5%)，振蕩搖勻，放置靜止 6min；后加入 1.0mL的硝酸鋁溶液(10%)，振蕩搖勻，放置靜止6min；再加入10.0mL的氫氧化鈉溶液(4%)，最后用對應的乙醇提取劑定容，振蕩搖勻后靜止15min，在λ=510 nm處測定吸光度。按照梁梓等的方法計算總黃酮含量(mg/g)[10]。

計算公式如下：N=C×V；黃酮含量（㎎/g）=N/M（N為樣液中總黃酮的質量，㎎；C為樣液中總黃酮的濃度，㎎/ml；V為提取液總體積，ml；M 為樣液中總黃酮質量，g）。

1.4 單因素試驗

1.4.1 不同乙醇體積分數對慈竹筍總黃酮提取的影響

準確稱取6份慈竹筍樣品(1.0 g)于離心管(50mL)中，向6支離心管中分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇提取劑40mL，將離心管放入50℃恒溫水浴鍋里加熱2.0 h，取出后進行離心，離心要求為：速度4000 r/min、離心10min，最后吸取上清液 1.0mL測吸光度。

1.4.2 不同提取溫度對慈竹筍總黃酮提取的影響

準確稱取6份慈竹筍樣品(1.0 g)于離心管(50mL)中，6支離心管中都加入30%的乙醇提取劑40mL，將離心管分別放入30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒溫水浴鍋中加熱2.0 h，取出后進行離心，離心要求為：速度4000 r/min、離心10min，最后吸取上清液 1.0mL測吸光度。

1.4.3 不同提取時間對慈竹筍總黃酮提取的影響

準確稱取6份慈竹筍樣品(1.0 g)于離心管(50mL)中，6支離心管中都加入30%的乙醇提取劑40mL，將離心管放入50℃的恒溫水浴鍋中加熱，分別于 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h后取出，取出后進行離心，離心要求為：速度 4000 r/min、離心10min，最后吸取上清液1.0mL測吸光度。

1.5 正交試驗優選提取工藝

根據單因素試驗的結果，選取對總黃酮提取有明顯意義的因素水平進行正交試驗，因素水平見表1，本試驗應采用 L16（45）正交實驗優選最佳提取工藝。

表1 正交試驗因素與水平

1.6 工藝驗證試驗

按照正交試驗結果優選出的提取工藝條件進行3次重復試驗，測定慈竹筍總黃酮含量，若總黃酮含量比正交試驗各單次試驗條件下獲得的總黃酮含量高，則表明優選出的工藝條件為最佳條件。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示，回歸方程為：y=16.323x-0.1011（R2=0.9833）。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 不同乙醇體積分數對慈竹筍總黃酮提取的影響

圖2 乙醇體積分數對慈竹筍總黃酮提取量的影響

由圖2可知，當乙醇體積分數為60%時，總黃酮含量最高，其他濃度的總黃酮含量都明顯低于它。當乙醇體積分數慢慢增大時，總黃酮含量總體上呈增加的趨勢，60%的乙醇體積分數總黃酮含量最高，當乙醇體積分數繼續增大時，總黃酮含量慢慢下降。因此，我們選取乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%這四個水平進行正交試驗。

2.2.2 不同提取溫度對慈竹筍總黃酮提取的影響

圖3 提取溫度對慈竹筍總黃酮提取量的影響

由圖3可知，最開始，當溫度升高時，總黃酮含量隨著溫度的升高而降低，當溫度大于40℃時，總黃酮含量又慢慢增加，50℃至60℃之間，黃酮含量又呈降低的趨勢，當溫度大于60℃時，總黃酮含量又慢慢提高，70℃至80℃之間，總黃酮含量增加最為明顯，且提取溫度為80℃時，總黃酮含量最高，但此時30%乙醇提取劑已經沸騰，會消耗大量提取劑。因此，我們選取溫度為50℃、60℃、70℃、80℃這四個水平進行正交試驗。

2.2.3 不同提取時間對慈竹筍總黃酮提取的影響

圖4 提取時間對慈竹筍總黃酮提取的影響

由圖4可知，在提取時間0.5 h至1.0 h之間，總黃酮含量慢慢增加，當提取時間為1.0 h時，總黃酮含量最高，當提取時間大于1.0 h時，隨著時間的增加，總黃酮含量不斷降低。因此，選取時間為 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 這四個水平進行正交試驗。

2.3 正交試驗結果

我們對正交試驗所得的結果進行了極差分析，所得結果如表2所示。

表2 正交試驗結果

因素Factor試驗號Test number A乙醇體積分數(%)Ethanol concentration B提取溫度(℃)Extraction temperature C提取時間(h)Extraction time總黃酮含量（mg/g）Total Flavonoids content 16 K1 K2 K3 K4 R 4 4127.44 89.64 118.12 107.44 107.00 28.48 87.92 104.72 112.88 116.68 28.76 104.44 106.00 107.00 104.76 2.56

由表2可知：影響總黃酮含量提取的因素順序為：提取溫度、乙醇體積分數、提取時間。根據直觀分析可得：在乙醇體積分數為60%、提取溫度80℃，提取時間1.5 h的條件下獲得的總黃酮含量最高，為32.24mg/g。根據極差分析可得：最佳的提取條件為60%乙醇，80℃的提取溫度，1.5 h的提取時間，即A2B4C3。因此，直觀分析所得結果與極差分析結果一致，所以不需要進行驗證試驗。

3 討論

本試驗得出慈竹筍總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數為60%，提取溫度為80℃，提取時間為1.5 h，此條件下獲得的慈竹筍總黃酮含量最高，為32.24㎎/g；影響總黃酮提取效果的因素順序為：提取溫度、乙醇體積分數、提取時間。對單因素試驗結果進行分析后可發現：當乙醇體積分數超過60%時，總黃酮含量下降明顯，可能是當乙醇體積分數過高，使得溶液極性增強，一些物質不再溶于其中而析出，與黃酮化合物競爭乙醇結構中的水分子，從而致使總黃酮溶解度降低，使總黃酮含量下降；當提取溫度為80℃時，慈竹筍總黃酮含量最高，但是此時30%的乙醇已處于沸騰狀態，乙醇由液態轉變為蒸汽態，會消耗大量乙醇。因此，如果考慮乙醇提取劑的用量問題，是消耗大量乙醇而獲得含量高的黃酮化合物，還是節省乙醇提取劑，減少經濟開支，還有待深入探討。

目前關于不同竹類不同器官黃酮含量及提取工藝均有大量研究，竹筍及竹葉作為竹子的主要組成部分，研究其黃酮含量具有重大意義。竹筍作為食用蔬菜，具有促進腸道蠕動，幫助消化的作用；經常吃竹筍患高血壓的幾率低，可能與竹筍中的黃酮類化合物有關[12]。王文文、袁藝等人在毛竹筍總黃酮提取工藝研究中得出總黃酮最高得率為1.063%[9]；楊永峰、黃成林在對3種苦竹竹筍黃酮類化合物的研究中獲得苦竹筍最高黃酮含量為13.48mg/g，得率為1.348%[13]；本實驗慈竹筍獲得總黃酮含量相比前兩者較高，為 32.24mg/g，得率為3.224%。因此，我們認為對慈竹筍總黃酮提取工藝的研究具備較大的現實意義。目前對于竹葉的研究更為廣泛，江帆、張倩如等對琴絲竹、毛竹、牧竹以及慈竹的竹葉進行了總黃酮提取，得出這四種竹的竹葉最高黃酮提取率依次為 9.58%、16.25%、5.49%、12.35%[14]。本實驗只針對慈竹筍作了研究，慈竹葉的黃酮含量是我們進一步的研究方向，以為更全面的利用慈竹提供理論依據。

4 結論

本試驗研究得出的慈竹筍優化工藝條件簡便可行，為利用慈竹筍藥用價值提供了技術參考，并增加了黃酮類化合物的提取途徑，提高了慈竹的經濟效益。

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Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids from Bamboo Shoots by Orthogonal Test

HU Xiɑ，CHEN Xiɑomei，LIAO Hɑn，YIN Penɡ，LIAO Yuɑn
（Sichuan Key Laboratory of Bamboo Diseases Prevention&Control and Resource Exploitation;School of Life Sciences，Leshan Normal University，Leshan Sichuan 614000，China）

In order to optimize the extraction technology for total flavonoids from bamboo shoot，this paper targets to provide technical reference for its medicinal value research.Taking the total flavonoids content as the index，the ethanol volume fraction，the extraction temperature and the extraction time as the inspection factors，the orthogonal test was carried out on the basis of single factor experiments.Meanwhile，the optimum extraction process of total flavonoids was selected from bamboo shoot.The analysis shows that:The optimum extraction conditions are extraction temperature (80℃)，ethanol concentration(60%)and extraction time(1.5h).Under this circumstance，the content of total flavonoids in bamboo shoot has reached its highest，32.24mg/g.Through the range analysis，factors influencing the sequence of three levels of total flavonoids are shown as follows:extraction temperature，ethanol concentration and extraction time.

Bamboo Shoots；Total Flavonoids；Orthogonal Test

A

1009-8666（2017）08-0010-06

［責任編輯、校對：李書華］

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.08.003

2017-03-13

四川省教育廳資助科研項目“竹材‘一刀切’的增產效應及其對竹林生態的影響”（16ZA0306）；國家自然科學基金項目“植物親緣選擇的生態學機制-驗證根際氮礦化假設”（31500346）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目“竹材‘一刀切’的增產效應及其對土壤生態的影響”（201610649036）

胡霞（1981—），女，四川成都人。樂山師范學院副教授，博士，研究方向：生態學；陳小美（1995—），女，四川德陽人。樂山師范學院本科生。