殼聚糖載體加載堿性成纖維細胞因子誘導成年大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)細胞的研究*

李曼麗，楊朝陽，李曉光

（1.北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院 北京 100191；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 神經(jīng)生物學系 北京 100069）

殼聚糖載體加載堿性成纖維細胞因子誘導成年大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)細胞的研究*

李曼麗1，楊朝陽2，李曉光1

（1.北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院 北京 100191；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 神經(jīng)生物學系 北京 100069）

目的利用生物材料在體外將骨髓間充質干細胞誘導為神經(jīng)元樣細胞。方法利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取骨髓間充質干細胞，并利用細胞表面抗原CD45和CD90進行鑒定。分為3組，單純殼聚糖組、加載了堿性成纖維細胞因子（bFGF）的殼聚糖組和單純bFGF組。分別在3和7 d時利用免疫熒光細胞化學檢測神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin、幼稚神經(jīng)元標記蛋白Tuj-1等指標的表達情況。結果加載了bFGF的殼聚糖處理細胞時，細胞在第3天出現(xiàn)了大量的Nestin陽性細胞，雖然在其他兩組中也出現(xiàn)了Nestin陽性細胞，但加載了bFGF的殼聚糖組比其他兩組多，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣的，在誘導7 d時，Nestin和Tuj-1雙陽性的細胞在加載了bFGF組中的比例要比其他兩組要多，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論加載有bFGF的殼聚糖能夠將成年大鼠骨髓間充質干細胞高比例誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。為骨髓間充質干細胞自體移植治療神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了理論和實驗依據(jù)。

殼聚糖；堿性成纖維細胞因子；骨髓間充質干細胞；神經(jīng)分化

殼聚糖為脫乙酰甲殼素，來源廣泛。殼聚糖由于游離氨基的存在，其反應活性比甲殼素強[1]。由于其價格低廉，具有良好的生物性能并且組織相容性和生物降解性良好[2]，逐漸在組織工程中廣泛應用。堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）由154個氨基酸組成，為FGF家族的一員，對促血管形成、誘導胚胎發(fā)育、促進神經(jīng)生長等功能有廣泛的作用，并在體內廣泛分布，其生物活性要比酸性成纖維細胞生長因子（acid fibroblast growth factor，aFGF）大近 10 倍[3]。有研究證實，bFGF 能夠促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元、膠質細胞等神經(jīng)細胞。

筆者之前的研究證實加載了NT-3的殼聚糖能夠緩釋NT-3誘導內源性神經(jīng)干細胞的增殖并遷移到脊髓損傷區(qū)修復脊髓損傷并改善其運動功能[4-5]。筆者也研究了殼聚糖加載bFGF后對神經(jīng)干細胞分化的影響，結果顯示殼聚糖加載了bFGF后誘導分化為神經(jīng)細胞的比例要比單純的殼聚糖和單純的bFGF的比例提高[6]。

神經(jīng)干細胞不能用于自體移植，可能會導致免疫排斥和倫理問題，而骨髓間充質干細胞易于獲取，可以取自自體，避免了上述問題，近年來已經(jīng)成為了細胞移植的熱門資源。本文主要研究殼聚糖加載bFGF誘導骨髓間充質干細胞向神經(jīng)細胞分化。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：成年Wistar大鼠，220 g左右。SPF級，首都醫(yī)科大學實驗動物部提供，許可證號：SYXK（京）2013-0004。

試劑：殼聚糖和bFGF（美國Sigma公司），Nestin和Tuj-1（美國Millipore公司），山羊抗兔或山羊小鼠熒光二抗（美國Invitrogen公司），Hoechst33342（美國Sigma公司），逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 成年骨髓間充質干細胞提取6%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉。75%酒精浸泡60 s，放置于冰上。采用無菌手術器械，剪開皮膚、肌肉暴露股骨和脛骨，利器剪斷置于含1%青鏈霉素的PBS中，體式顯微鏡下剝除殘余肌肉和筋膜等，洗掉油脂和浮血，清洗3次后，注射器吸取2 ml含10%FBS的DMEM將骨髓沖出于含8 ml培養(yǎng)基的10 cm平板中。注射器吹打將細胞吹散，于濕潤的37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)為P0代。

1.2.2 成年骨髓間充質干細胞培養(yǎng)傳代 P0代培養(yǎng)24 h后全換液，之后2～3 d全換液，待細胞生長至80%～90%融合進行傳代，傳代時先用PBS洗滌細胞2次，2 ml 0.25%胰酶消化，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，將細胞平均分到2個平板中，相同條件下傳至P3代以待下一步處理。

解析本地區(qū)的中考卷要從“類”著手，再將“類”分成若干個小類，那么每小類相當于類中的一個“點”，通過對每個小類命題的解析，引導學生思考每小類之間的不同點，尋求小類命題的共同點，由小類到大類的歸納中抽象出質的東西.

1.2.3 骨髓間充質干細胞鑒定 將P3代細胞以1×105個/cm2密度種植于6孔板中，待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗3遍。每孔加入含EDTA的胰酶0.5 ml消化2 min，加入等體積胰酶終止消化，收集細胞到EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1ml PBS洗1次，同樣1000r/min離心5 min，棄上清加入熒光標記Ⅰ抗（PE-Cy5-labeled anti-Rat CD45/FITC-labeled anti-Rat CD90）平均每 106個細胞加1μl，冰上孵育40 min后，PBS洗滌1次，5 min，上機檢測。

1.2.4 骨髓間充質干細胞誘導分化 P3代細胞以1×105個/cm2密度種植于放置有多聚賴氨酸包被過蓋玻片的6孔板中。24 h后待細胞貼壁，每孔分別添加不同的誘導劑：10 mg/ml殼聚糖，單純bFGF組向培養(yǎng)基中加入20 ng/ml bFGF，bFGF-殼聚糖載體組向培養(yǎng)基中加入10 mg/ml加載有bFGF的殼聚糖。每2～3 d半量換液1次。

1.2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測 Trizol法提取全RNA，用含有去除基因組DNA的gRemover的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，之后以cDNA為模板，Nestin正向引物：GAGGACCAGG AGGCATGTAG，反向引物：TCTTCTGGAGACCTCAGG GA；GAPDH 正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATT TG，反向引物：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.2.6 免疫熒光染色 PBS洗3次，5 min/次。4%的多聚甲醛4℃固定40 min。PBS洗掉多聚甲醛，并用0.3%TritonX-100破膜5 min。之后1%正常山羊血清（NGS）于37℃中孵育30 min。加入相應一抗，濃度分別為 Nestin 1∶100 Tuj-1 1∶100，37℃孵育2h，PBS洗掉多余一抗后加入Alexa594和Alexa 488標記的山羊抗兔或山羊小鼠熒光二抗（1∶300），37℃孵育1 h。PBS洗掉多余二抗后，Hoechst33342（1∶1 000）染核。去離子水洗掉多余染料，50%PB甘油封片后BX51熒光顯微鏡成像。

1.2.7 圖像分析 DP Controller中成像并隨機選取20個視野拍照，分別計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)和傳代生長狀態(tài)

骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)時細胞貼壁后形狀不規(guī)則且細胞數(shù)目較少，待生長1～2 d后，細胞開始有小的突起進而其形態(tài)變?yōu)殚L梭形。細胞傳代后，依然保持長梭形的形態(tài)但增殖速度明顯增加。見圖1。

2.2 骨髓間充質干細胞鑒定結果

利用骨髓間充質干細胞在塑料制品中的貼壁性，采用全細胞貼壁法，去除不貼壁細胞。傳代3次后流式細胞術鑒定細胞表面抗原。經(jīng)鑒定，95%以上的細胞為CD45-/CD90+細胞。即95%以上為骨髓間充質干細胞。見圖2。

2.3 骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)干細胞

圖1 骨髓間充質干細胞正常形態(tài) （×200）

圖2 細胞表面抗原流式細胞術鑒定結果

圖3 各組N est i n表達情況

如圖3所示，誘導1 d后，加載bFGF的殼聚糖組中能夠看到細胞開始有突起，細胞形態(tài)開始向神經(jīng)細胞形態(tài)發(fā)展。在單純殼聚糖組中細胞形態(tài)基本沒有變化，單純bFGF組中細胞形態(tài)也發(fā)生了變化，但變化不明顯（見圖2）。誘導3 d后，這種變化進一步加劇，即單純殼聚糖誘導細胞幾乎沒有Nestin+細胞，但單純bFGF和加載有bFGF的殼聚糖誘導細胞時，Nestin+細胞更多，細胞突起更長。RT-PCR也能夠檢測到誘導3 d后在加載了bFGF的殼聚糖組中Nestin的RNA表達水平要比單純bFGF組的表達量高，單純殼聚糖組中幾乎沒有Nestin的表達。并且表達Nestin的細胞聚集成團狀，形成類神經(jīng)球的結構。

2.4 骨髓間充質干細胞由神經(jīng)干細胞繼續(xù)分化為幼稚神經(jīng)元

為了驗證這些具有神經(jīng)干細胞特征的細胞是否能夠進一步向神經(jīng)細胞分化，本研究增加了誘導時間，在誘導7 d時檢測幼稚神經(jīng)元標記蛋白Tuj-1和神經(jīng)干細胞標記蛋白的共標情況。結果發(fā)現(xiàn)，在加載有bFGF的殼聚糖組，能夠檢測到大量Nestin+和Tuj-1+雙標細胞。在單純bFGF組能夠檢測到雙標細胞但是數(shù)量不多。單純殼聚糖組沒有檢測到雙標細胞。見圖4。

圖4 各組神經(jīng)干細胞向幼稚神經(jīng)元分化情況

3 討論

神經(jīng)退行性疾病是目前危害人類健康和生活質量的疾病之一。神經(jīng)退行性疾病主要是由于神經(jīng)細胞損傷、凋亡、崩解或是傳導通路受阻造成的。為了解決這些問題，研究者們致力于研究補充損失的神經(jīng)細胞。為此，細胞誘導分化成為了研究熱點。

神經(jīng)干細胞作為神經(jīng)細胞的祖細胞，就是分化為神經(jīng)細胞，這其中包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞。但是，成年動物內源性NSCs主要位于海馬齒狀回顆粒細胞下層、側腦室下區(qū)、脊髓中央管室管膜區(qū)[6-8]，細胞資源較少，且不適宜自體移植。這樣就涉及免疫排斥和倫理問題，并具有成瘤風險。骨髓間充質干細胞臨床上易于獲得并對患者創(chuàng)傷較小能夠自體移植，不涉及免疫排斥和倫理問題，最近已經(jīng)成為了細胞移植的明星細胞。

殼聚糖為去乙酰化的甲殼素，在自然界中來源廣泛[9]。具有游離的氨基使其具有更強的反應活性。殼聚糖具有良好的生物組織相容性，能夠在體內降解[10]，在生物材料中研究較廣泛。筆者之前的研究證實，殼聚糖在結合NT-3后能夠在培養(yǎng)體系中緩釋14周以上[11-13]。解決了生長因子半衰期短，給藥方式不適合臨床等問題。

本研究采用了全骨髓貼壁法提取骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞在塑料制品中具有貼壁的性質，全骨髓貼壁法能夠去除大部分的其余細胞。利用流式細胞術通過檢測細胞表面抗原95%的細胞為CD45-/CD90+細胞。說明此方法能夠得到較高純度的骨髓間充質干細胞。為下一步的誘導分化做出了準備。

誘導1 d后，單純殼聚糖組形態(tài)與正常的BMSC相似。說明BMSC不經(jīng)過誘導處理并不能夠自發(fā)的分化為神經(jīng)干細胞。而加載了bFGF的殼聚糖組和單純bFGF組的細胞形態(tài)發(fā)生了變化，細胞開始有了少量突起，單純bFGF組類似，說明在短時間內單純bFGF和加載了bFGF的殼聚糖組可能在誘導效果上類似，主要是因為單純bFGF在短時間內還能夠保持一定的濃度和效用。

誘導3 d后，單純殼聚糖組還是沒有變化，單純bFGF組和加載了bFGF的殼聚糖組誘導效果出現(xiàn)了差異。加載了bFGF殼聚糖組的Nestin表達要比單純殼聚糖組多，同樣細胞形態(tài)也均發(fā)生了變化，說明誘導3 d時加載了bFGF的殼聚糖組的誘導效果要比單純殼聚糖組明顯，可能是由于將bFGF加載到殼聚糖中，能夠使bFGF緩慢釋放，具有持續(xù)的誘導效果。本課題組先前的報道顯示加載了NT-3的殼聚糖具有緩釋NT-3的效果，并且緩釋時間能夠持續(xù)14周[13]。同樣說明骨髓間充質干細胞在向神經(jīng)細胞分化的過程中是先分化為神經(jīng)干細胞，形成神經(jīng)球狀細胞后，才進行下一步分化。待誘導7 d后，細胞出現(xiàn)了Nestin和Tuj-1雙標細胞，更說明了這些新生的誘導來的幼稚神經(jīng)元是經(jīng)神經(jīng)干細胞分化來的。同樣，3組誘導結果還是有差異的。MSC在經(jīng)加載了bFGF的殼聚糖的誘導，持續(xù)的bFGF的釋放導致MSC受到持續(xù)的bFGF的誘導，更多的細胞分化為了幼稚神經(jīng)元。單純bFGF在體內的降解較快，半衰期只有幾分鐘，所以單純bFGF組中只有少量的Nestin和Tuj-1雙標細胞。而單純殼聚糖組由于缺乏誘導因素，只有極少量的細胞甚至是沒有細胞能夠分化為Nestin和Tuj-1雙標細胞。

本文結合了本課題組之前的研究，將bFGF加載到殼聚糖中研究其對骨髓間充質干細胞的誘導情況。擴展了殼聚糖緩釋細胞因子的種類。證明了殼聚糖不僅能夠緩釋NT-3，同樣也能夠緩釋bFGF。并且能夠達到很好的誘導效果。為將殼聚糖緩釋細胞因子應用于臨床奠定了基礎。另外，本實驗主要針對MSC，對于自體移植給藥都是很大的創(chuàng)新。為修復神經(jīng)退行性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷開辟了新思路。

[1]孫璠,徐民,李克讓.甲殼素和殼聚糖在離子液體中的溶解與改性[J].化學進展.2013,25(5):823-837.

[2]DHIMAN H K,RAY A R,PANDA A K.Characterization and evaluation of chitosan matrix for in vitro growth of MCF-7 breast cancer cell lines[J].Biomaterials,2004,25(21):5147-5154.

[3]張悅,胡楊,沈玉鳳.bFGF/BMP-2轉染大鼠骨髓干細胞體內成牙的研究[J].口腔醫(yī)學研究,2016,32(3):239-243.

[4]YANG Z,ZHANG A,DUAN H,et al.NT3-chitosan elicits robust endogenous neurogenesis to enable functional recovery after spinal cord injury[J].Proc Natl Acad Sci,2015,112(43):13354-13359.

[5]DUAN H,GE W,ZHANG A,et al.Transcriptome analyses reveal molecular mechanisms underlying functional recovery after spinal cord injury[J].Proc Natl Acad Sci,2015,112(43):13360-13365.

[6]王聰,楊朝陽,段紅梅,等.堿性成纖維細胞生長因子-殼聚糖載體誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化并形成突觸的研究[J].中國康復理論與實踐,2015,21(4):406-411.

[7]GAGE F H.Mammalian neural stem cells[J].Science,2000,287(5457):1433-1438.

[8]ZHAO C M,DENG W,GAGE F H.Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis[J].Cell,2008,132(4):645-660.

[9]王雯靜,桑秋章,邵宇,等.基于甲殼素的手性分離材料[J].材料導報,2016,30(1):53-60.

[10]PUVANESWARY S,TALEBIAN S,RAGHAVENDRAN H B，et al.Fabrication and in vitro biological activity of βTCP-Chitosan-Fucoidan composite for bone tissue engineering[J].Carbohydr Polym,2015,10(134):799-807.

[11]LI X G,YANG Z Y,ZHANG A F.The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells[J].Biomaterials,2009,30(2009):4978-4985.

[12]MO L H,YANG Z Y,ZHANG A F,et al.The repair of the injured adult rat hippocampus with NT-3-chitosan carriers[J].Biomaterials,2010,31(2010):2184-2192.

[13]YANG Z Y,DUAN H M,MO L H,et al.The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells[J].Biomaterials,2010,31(2010):4846-4854.

（張蕾 編輯）

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of adult rat into nerve cells induced by chitosan carrier loaded with bFGF*

Man-li Li1,Zhao-yang Yang2,Xiao-guang Li1
(1.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.Department of Neurobiology,School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

ObjectiveTo inducein vitrodifferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells by biological material.MethodsUsing bone marrow adherent characteristic,bone marrow mesenchymal stem cells were extracted.Then the cells were identified by cell surface antigens CD45 and CD90.The cells were divided into three groups namely pure chitosan,chitosan-loaded bFGF group and bFGF group.The expressions of neural stem cell marker Nestin and neuron-like cell marker Tuj-1 were evaluated using immunocytochemical method on the 3rd and 7th d respectively.ResultsThe proportion of Nestin-positive cells in the bFGF loaded group on the 3rd day was significantly higher than that in the other two groups(P＜0.05).Similarly,the proportion of Nestin and Tuj-1 double positive cells in the bFGF loaded group was significantly higher than that in the other two groups on the 7th day of induction(P＜0.05).ConclusionsbFGF-loaded chitosan can induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of adult rat into neuron-like cells at a high proportion,which provides a theoretical and experimental evidence for autologous transplantation in the treatment of neurodegenerative diseases and centralnervous system injury.

chitosan;bFGF;BMSC;neuronal differentiation

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.001

1005-8982（2017）13-0001-05

2016-12-16

國家國際科技合作專項項目（No：2014DFA30640）

李曉光，E-mail：lxgchina@sina.com；Tel：010-83950083