兒童神經母細胞源性腫瘤的形態及分子遺傳學改變及臨床意義

許恪淳，管雯斌，許艷春，王曉穎，王立峰，祝明潔

兒童神經母細胞源性腫瘤的形態及分子遺傳學改變及臨床意義

許恪淳，管雯斌，許艷春，王曉穎，王立峰，祝明潔

目的探討兒童神經母細胞源性腫瘤的組織學特征、免疫表型及MYCN擴增特點，判斷其生物學行為及預后。方法分析100例神經母細胞瘤(neuroblastoma, NB)及節神經母細胞瘤(ganglioneuroblastoma, GNB)的組織學形態、免疫表型及60例MYCN擴增。結果100例NB及GNB患兒，平均年齡2.7歲，男性多于女性；NB分為未分化型、差分化型、分化型；GNB分為混合型(iGNB)和結節型(nGNB)。免疫表型：神經母細胞不同程度的表達NSE、NF、PGP9.5、Syn、CgA；Schwannian細胞表達S-100、GFAP。11.67%的患者伴MYCN擴增，iGNB無MYCN擴增。結論神經母細胞源性腫瘤的診斷主要根據組織學形態，特殊檢查(免疫組化、電鏡和細胞遺傳學)可以幫助鑒別未分化的母細胞成分。神經母細胞源性腫瘤的預后根據患者年齡、腫瘤的分型分期、分子遺傳學改變等指標綜合評估。

神經母細胞瘤；節神經母細胞瘤；診斷標準；分子生物學；預后

神經母細胞源性腫瘤起源于原始神經嵴細胞，好發于嬰幼兒及兒童，根據腫瘤的不同分化及成熟程度分為神經母細胞瘤(neuroblastoma, NB)、節神經母細胞瘤(ganglioneuroblastoma, GNB)及節細胞神經瘤(ganglioneuroma, GN)。本文現收集100例NB及GNB的患者進行臨床病理分析，并結合文獻復習其診斷及鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2013～2016年上海交通大學附屬新華醫院病理科診斷為NB和GNB的100例。100例患兒中，女性37例，男性63例，男性發病率高于女性患者。患兒年齡21 h～13歲，平均發病年齡2.7歲。未分化型及差分化型NB平均2歲，分化型NB平均2.9歲。混合型節神經母細胞瘤(iGNB)患者平均年齡4歲，結節型節神經母細胞瘤(nGNB)患者平均年齡3.7歲，NB比GNB平均發病年齡稍小。該腫瘤好發于腎上腺/后腹膜(69%)，其次是縱隔(18%)、椎管(6%)、骶尾部(3%)，還包括其他一些少見部位：腹腔(2%)、頸部(1%)、肝臟(1%)。

1.2方法所有切除標本均經10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋，4 μm厚連續切片，HE染色。由兩位病理科醫師采用雙盲法在顯微鏡下進行觀察和分型。

1.3免疫組化所有標本均經免疫組化采用EnVision法染色，觀察NSE、NF、PGP9.5、Syn、CgA、S-100、GFAP等標志物在NB和GNB中的表達情況。相關試劑、二抗及DAB顯色劑均購自上海長島公司。

1.4FISH檢測利用位點特異性MYCN/CEP2雙色探針檢測MYCN改變，其中橙色熒光標記2號染色體的α衛星DNA(CEP2)，以計數2號染色體的數目；MYCN以綠色熒光標記。探針與靶基因雜交后，在橙綠濾光片下觀察，正常間期細胞核中，顯示2個橙色、2個綠色熒光信號。若存在2號染色體或MYCN數目異常時，細胞核中橙色或綠色信號則增多或減少。若MYCN拷貝數目增加時，相對于2號染色體數目，每單倍體基因組中MYCN拷貝數的增加介于4～100稱為擴增，MYCN拷貝數增加介于1～4為獲得。所用探針均購自美國Vysis/Abbott公司。

2 結果

2.1病理檢查眼觀：NB為分葉狀腫塊，直徑1～10 cm，平均6 cm，質嫩，切面呈灰白色，局部灰紅色，化療后標本局灶伴鈣化及壞死。iGNB為棕褐色-白色結節狀腫塊，直徑1.5～13 cm，平均6 cm。nGNB為一個或多個結節狀腫塊，直徑3～17 cm，平均7.8 cm，切面常見部分結節為灰紅色/出血性。鏡檢：國際神經母細胞瘤病理學會推薦使用由Shimada等[1]提出的分類方案，本組診斷69例NB，根據腫瘤組織中Schwannian細胞基質稀少/缺乏及神經母細胞的分化程度，包括3個亞型：未分化型4例(圖1A)、差分化型43例(圖1B)、分化型22例(圖1C)。診斷31例GNB，根據腫瘤組織中NB成分與周圍基質(包括GN或Schwannian基質)的構成方式，診斷iGNB 20例，nGNB 11例，iGNB組織學表現為富于Schwannian基質，NB成分呈多灶狀/小巢分布在基質中(圖1D)；nGNB組織學形態為富于Schwannian基質/Schwannian基質優勢和基質少，神經母細胞成分與GN成分之間有明顯的分界。nGNB包括4個組織學變異型：經典型(7例)、多結節型(2例)、大結節型(1例)和無結節型(1例)。

2.2免疫表型神經母細胞均可不同程度的表達一種或幾種神經源性標志物，包括NF(圖2A)、PGP9.5、Syn(圖2B)、CgA、NSE，未分化型4例，其中1例Syn、CgA均呈陰性。Schwannian基質表達S-100(圖2C)、GFAP(圖2D)。

2.3MYCN基因檢測60例NB和GNB：未分化型NB(1/4)、差分化型NB(4/31)、分化型NB(1/8)、nGNB(1/5)均有MYCN擴增，且平均拷貝數/細胞>4個信號位點；iGNB(0/12)均無MYCN擴增。

3 討論

神經母細胞腫瘤臨床罕見，是5歲以下兒童最常見的實體腫瘤之一，很少發生于成人。本組神經母細胞腫瘤好發年齡2～4歲，男性發病率高于女性。NB發生于兒童期腎上腺和交感神經，是來自于神經嵴的神經外胚層移行細胞的胚胎型腫瘤。常見部位是腎上腺/后腹膜、縱隔，少見發生于椎管內、骶尾部、腹腔、頭頸部、肝臟、甲狀腺、肺、腎臟[2]。

3.1診斷NB的組織學特點：Schwannian基質少/缺乏，主要由神經母細胞組成，瘤細胞生成的軸索構成嗜酸性原纖維網，稱為神經纖維網/神經氈。瘤細胞圍繞中心無空腔結構的神經元纖維形成典型，即Homer-Wright菊形團。NB分為3個亞型：(1)未分化型，由幼稚的小圓細胞組成，均為母細胞，彌漫性生長，無明顯的節細胞分化，無神經氈和菊形團結構。診斷需借助特殊檢查(免疫組化、電鏡或細胞遺傳學)，免疫組化選擇性的表達一種或幾種神經源性標志物，一般均表達NF、PGP9.5，部分病例不表達Syn及CgA。(2)差分化型，3亞型中最為常見，腫瘤細胞小，核質比高，可形成Homer-Wright菊形團，可見神經氈背景，節細胞分化<5%，表現為細胞核和胞質的分化，分化神經母細胞核的特征為核大、染色質空泡狀、單個明顯的核仁偏心性位于核內；胞質的特質為嗜酸性/雙嗜性，直徑是核的2倍以上。(3)分化型，伴大量神經氈背景，節細胞分化>5%，局部區域可以向iGNB過渡，但iGNB樣區域的量必須少于50%[3]。

①A①B①C①D②A②B②C②D

圖1神經母細胞腫瘤的組織學形態：A.未分化的神經母細胞；B.差分化的母細胞及神經氈背景；C.分化的母細胞及神經氈背景；D.神經母細胞巢混雜于基質中圖2A.NF表達于神經母細胞膜，EnVision法；B.Syn表達于神經母細胞膜和細胞質，EnVision法；C.S-100表達于Schwannian細胞膜和細胞質，EnVision法；D.GFAP表達于Schwannian細胞膜和細胞質，EnVision法

GNB的診斷及分型要點依據NB成分與周圍基質的構成方式。(1)iGNB為Schwannian基質豐富的腫瘤，NB成分呈多灶狀、小巢狀分布在Schwannian細胞基質中，灶性分布的NB成分由不同分化階段的神經母細胞及神經氈背景組成。周圍的Schwannian基質中可見成熟和即將成熟的節細胞。NB成分未形成獨立的結節狀結構。iGNB可以看做是NB向成熟的GN分化的中間過程，其組織學形態與完全分化、成熟的GN有重疊或過度。部分分化型NB與iGNB鏡下的圖像可有重疊，因此我們要求Schwannian基質成分占腫瘤組織50%以上才可以診斷為iGNB。(2)nGNB的診斷大體表現非常重要，通常可見神經母細胞性結節，肉眼表現為出血性的腫瘤結節。常與iGNB或GN同時存在。鏡下神經母細胞性結節與周圍間質出現明確的分界，神經母細胞性結節周圍間質呈GN圖像或iGNB圖像。根據結節的分布特征，可以分為4個組織學變異型[4]：經典型、多結節型、大結節型和無結節型。經典型：大體可見神經母細胞結節，鏡下神經母細胞結節與周圍間質有明顯分界；多結節型：大體可見2個以上神經母細胞結節，鏡下與經典型一致；大結節型：因NB結節巨大，占據腫瘤的主要部分，鏡下僅可見腫瘤邊緣有少量iGNB或GN腫瘤組織成分；無結節型：原發的腫瘤呈iGNB或GN圖像，但淋巴結、骨或其他部位的轉移灶中呈NB圖像。nGNB可作為1個多克隆的復合型腫瘤，它包含的多種成分生物學行為不同。出血性NB結節，代表侵襲性強的部分，而iGNB或GN成分，代表侵襲性差的克隆。在這種多克隆的腫瘤中，不同成分的基因表達可以是不相同的[5]。國際神經母細胞瘤的組織學分型(Shimada標準)，根據患者年齡、腫瘤組織學類型及核分裂-核碎裂指數(MKI)，分為預后好/預后差型。預后好型按年齡分2組： <1.5歲的差分化型或分化型腫瘤，伴低(<2%)或中(2%～4% )MKI；1.5～5.0 歲的分化型和低MKI。預后差型按年齡分4組：<1.5 歲的未分化型腫瘤；1.5～5.0 歲的未分化或差分化型腫瘤 伴中/高MKI；>5歲的任何亞型；任何年齡的高MKI腫瘤。低MKI:<2%或<100/5 000細胞；中MKI：2%～4% 或100～200/5 000細胞；高MKI：>4%或>200/5 000細胞。nGNB根據腫瘤中NB成分，按Shimada標準分型[4]。

3.2鑒別診斷鑒別診斷 GN成熟中型：此型主要與iGNB鑒別，兩者均可見Schwannian基質，并可見各種分化程度的神經母細胞和節細胞。前者中腫瘤基質均為叢狀基質，由Schwannian細胞和神經膜細胞的突起構成，分化的神經母細胞和節細胞散在分布于叢狀基質中，而iGNB的神經母細胞巢的背景為神經氈樣的神經纖維網，散在各種分化程度的神經母細胞，包括神經母細胞、分化的神經母細胞和(或)節細胞，周圍圍繞富于Schwannian基質的GN成分。與nGNB的區別在于后者存在NB結節或NB原發灶。其他類型的小細胞惡性腫瘤：主要包括原始神經外胚層腫瘤/尤因肉瘤、淋巴瘤、橫紋肌肉瘤等，主要與未分化型NB鑒別。鑒別診斷需借助免疫組化染色或基因檢測等特殊檢查。

3.3分子遺傳學改變了解神經母細胞腫瘤的分子病理及基因改變，有助于評估預后，并指導臨床個體化治療，減少化療帶來的毒副反應，并對傳統化療藥物不敏感的病例進行更強和新型的治療。(1)MYCN：擴增常出現于未分化/差分化的神經母細胞。如果腫瘤出現MYCN擴增，并伴高增殖指數及較多凋亡(高MKI)，提示腫瘤可能有較差的預后[6]。本組中并未發現iGNB伴MYCN擴增，與以上幾種類型相比，iGNB的MYCN擴增罕見，證明iGNB預后好。當腫瘤的組織學分型與基因分型不一致，即腫瘤組織學分型為預后好型，但伴MYCN擴增，研究指出伴MYCN擴增患者組的預后比無MYCN擴增組預后差[7]。因此，檢測腫瘤的MYCN對于判斷腫瘤的預后非常重要。(2)染色體異常：在局限性和播散的神經母細胞的腫瘤細胞中發現多個染色體異常。1p染色體缺失和17q染色體擴增最為常見，但它的臨床意義并沒有MYCN擴增有意義。11q染色體的缺失較少見，如果同時伴MYCN擴增，更有臨床意義。在新的神經母細胞腫瘤國際分期和危險度分級中，11q染色體的缺失也作為提示年齡小于18個月的嬰幼兒預后差的因子之一[8-9]。(3)基因表達異常：神經母細胞腫瘤中，很多基因表達上調或下調，可能與預后相關。與預后密切相關是MYCN擴增，但僅約20%的腫瘤具有MYCN擴增，其余基因包括：59-基因標記、199-基因標記等。目前，由于RNA在腫瘤中的不穩定性，基因標記還未被臨床采納作為評估預后的因子。(4)TrkA、CD44、ALK、Glut1：與NB相關的TRK基因家族，包括TRKA、TRKB和TRKC，他們在NB的進展中起不同作用。NB的分化過程中TRKA高表達，提示其預后較好，且可以下調MYCN[10]。CD44在很多組織中均有表達，包括GNB和約50%的未分化NB。CD44的表達且無MYCN擴增，提示預后較好，CD44失表達提示預后差[11]。ALK被認為是NB的易感基因之一，在進展期的NB和乏基質的NB中有過表達現象，特別是在伴MYCN擴增時，提示預后差，且活化的ALK受體可以作為小分子抑制劑的靶點用于腫瘤的靶向治療[12-13]。Glut1在NB和nGNB中存在過表達，提示患者預后較差[14]。

3.4預后判斷腫瘤預后重要指標有患者年齡、臨床分期和MYCN擴增。隨著患者年齡增大，腫瘤的轉移風險提高及預后較差。小于12個月的NB患者，一般無MYCN擴增，大部分為自然消退，預后較好；大于18個月的NB患者，提示預后較差；大于12歲的NB患者10年生存率較低(<10%)[9]。臨床、病理醫師診斷時，需綜合考慮腫瘤分型(Shimada標準)及分子遺傳學改變等其他因素。iGNB任何年齡段的預后均較好，且無MYCN擴增，預后與GN相似[15]。

綜上所述，正確認識神經母細胞腫瘤的組織學形態及免疫表型，并結合其生物遺傳學改變為患者治療提供更多的臨床依據，對預測該腫瘤的生物學行為及預后非常重要。

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Childrenperipheralneuroblastictumor:pathology,biologyanditsclinicalsignificance

XU Ke-chun, GUAN Wen-bin, XU Yan-chun, WANG Xiao-ying , WANG Li-feng, ZHU Ming-jie

(DepartmentofPathology,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

PurposeTo summarize the histological, immunophenotypic feature and MYCN (MYC gene) amplification results of peripheral neuroblastic tumours in children,and to predict its biological behavior and prognosis.MethodsThe histology and immunophenotype of 100 cases of neuroblastoma (NB) and ganglioneuroblastoma (GNB) were retrospectively analysed, MYCN status was detected in 60 cases.ResultsAmong The average age of 100 cases of GN and GNB was 2.7 years old, and that of males was more than that of females. NB could be divided into three subtypes: undifferentiated, poorly differentiated and differentiating. GNB could be divided into two subtypes: intermixed (iGNB) and nodular (nGNB). Immunohistochemical staining showed neuroblastoma cells were positive for NSE, NF, PGP9.5, Syn, CgA in varying degree. Schwann cells were positive for S-100 and GFAP. MYCN amplification was detected in 11.67% of the cases, and no MYCN amplification was seen in iGNB patients.ConclusionThe diagnosis of peripheral neuroblastic tumours is mainly based on histological morphology, special tests (immunohistochemistry, electron microscope and cytogenetics) can helpful for identifing undifferentiated neuroblastoma cells. The prognosis of neuroblastoma derived tumors is evaluated according to the age of patients, the classification and staging of tumors, and molecular genetic alterations.

neuroblastoma； ganglioneuroblastoma； diagnostic criteria； biology； prognosis

時間：2017-7-18 11:51 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.009.html

上海交通大學醫學院附屬新華醫院病理科，上海 200092

許恪淳，女，碩士，主治醫師。E-mail: xukechun@xinhuamed.com.cn 祝明潔，女，碩士，副主任醫師，通訊作者。E-mail: m-jzhu@hotmail.com

R 739.4

:A

:1001-7399(2017)07-0746-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.009

接受日期：2017-05-19