無核葡萄自交胚挽救技術(shù)研究

田淑芬，溫曉敏,2，張娜，月丫,2，路鳳珍,2

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

無核葡萄自交胚挽救技術(shù)研究

田淑芬1，溫曉敏1,2，張娜1，月丫1,2，路鳳珍1,2

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

本文以二倍體種子敗育型無核品種奧迪亞無核、紅寶石無核、希姆勞特、無核白雞心自交胚珠為材料，分析親本基因型、取樣時期、胚發(fā)育培養(yǎng)溫度對無核葡萄胚挽救效果的影響。結(jié)果顯示：親本選擇對胚挽救效果影響顯著，不同品種自交胚發(fā)育率和萌發(fā)率從高到低為：奧迪亞無核自交、紅寶石無核自交、希姆勞特自交、無核白雞心自交；不同品種自交最佳取樣期不同，奧迪亞無核、希姆勞特自交最佳取樣期為授粉后54 d，紅寶石無核自交胚珠最佳取樣期為授粉后61 d；奧迪亞無核、紅寶石無核的自交胚珠在25 ℃培養(yǎng)的胚發(fā)育率都顯著高于4 ℃條件下胚發(fā)育率，胚珠在低溫下培養(yǎng)會抑制胚的發(fā)育。

無核葡萄；自交育種；胚挽救

無核葡萄因食用方便深受廣大消費者喜愛，選育品質(zhì)優(yōu)良的無核葡萄新品種已成為當(dāng)前國內(nèi)外葡萄育種的重要目標(biāo)之一[1]。以無核品種為親本培育新品種，避免使用激素進行無核化處理對植株正常生理周期的干擾和對葡萄果實品質(zhì)的影響。但以無核品種為親本雜交胚易敗育，胚挽救技術(shù)較傳統(tǒng)雜交育種擴大了親本的選擇范圍，提高了后代無核率，可縮短育種周期[2-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，胚挽救技術(shù)已成為無核葡萄主要育種方法之一。

在胚挽救育種研究中，對幼胚成苗率的影響因素如親本選擇、取樣時期、基本培養(yǎng)基種類、外源添加物、移栽方法等對胚挽救育種效果的意義重大。國內(nèi)很多學(xué)者閆愛玲、唐冬梅等[5-9]均做過很多工作，并取得了顯著成績。本研究以二倍體種子敗育型無核品種奧迪亞無核、紅寶石無核、希姆勞特、無核白雞心自交胚珠為材料，分析親本選擇、取樣時期、胚發(fā)育培養(yǎng)溫度對無核葡萄胚挽救效果影響。探索親本選擇、取樣時間、胚發(fā)育培養(yǎng)溫度對胚挽救效果的影響，旨在為無核葡萄胚挽救育種的親本選擇、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年4～12月在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心武清試驗基地、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室進行。供試材料為4種無核葡萄：奧迪亞無核、希姆勞特、紅寶石無核、無核白雞心。

1.2 試驗方法

1.2.1套袋自交

花前1～3 d選擇4個品種葡萄各15穗，進行疏花套袋。

1.2.2幼果采集

授粉33 d后開始，每7 d采摘1次自交幼果，每次150粒，共采摘5次。剪去果柄，自來水沖洗15 min。在超凈工作臺消毒：先用75%酒精沖洗1次，用無菌水沖洗1次，放入次氯酸鈉中浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次。

1.2.3胚發(fā)育階段胚珠培養(yǎng)

消毒后，將取出的胚珠接種在Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂+1 g/L活性炭培養(yǎng)基（pH=5.8）上進行胚發(fā)育培養(yǎng)。并將這些自交胚珠分別在25 ℃、4 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.4胚萌發(fā)階段胚培養(yǎng)

培養(yǎng)60 d后，在超凈工作臺上對胚珠進行剝胚，然后接種到胚萌發(fā)培養(yǎng)基WPM+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂+1.5 g/L活性炭（pH=5.8）中培養(yǎng)，30 d后調(diào)查。剝胚統(tǒng)計胚發(fā)育情況。若解剖鏡下看到亮白色胚，則胚發(fā)育；若無亮白色胚（胚珠內(nèi)無胚或胚褐化），則胚敗育。

胚發(fā)育率/%=（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100；胚萌發(fā)率/%=（萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本選擇對幼胚生長發(fā)育的影響

從表1可以看出，胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率由高到低為：奧迪亞無核自交＞紅寶石無核自交＞希姆勞特自交＞無核白雞心自交。不同無核品種自交，胚挽救難易程度差異大，說明親本的選擇對胚挽救效果影響顯著。

2.2 不同雜交組合取樣時期的確定

雜交胚珠在授粉33 d后，分5次取樣接種。統(tǒng)計不同取樣時期的胚珠發(fā)育率與幼胚萌發(fā)率。由表2可知，隨著紅寶石無核自交胚珠隨著取樣時間的推遲，胚發(fā)育率從0.65%逐漸增大至14.29%，胚萌發(fā)率同樣逐漸提高，到花后61 d達(dá)到9.64%，說明在花后61 d取樣進行胚挽救更為有效。奧迪亞無核、希姆勞特自交胚珠均在授粉后54 d取樣，胚發(fā)育率和萌發(fā)率均達(dá)到最高，說明在花后54 d取胚珠進行胚挽救更為有效。無核白雞心取樣期胚發(fā)育率和萌發(fā)率都極低，萌發(fā)、發(fā)育胚數(shù)少不能說明其最佳取樣期。

2.3 低溫培養(yǎng)對幼胚發(fā)育率的影響

奧迪亞無核、紅寶石無核的自交胚珠在25 ℃培養(yǎng)的發(fā)育率都顯著高于4 ℃條件下胚珠發(fā)育率（表3）。說明胚珠低溫培養(yǎng)會抑制胚發(fā)育。

表1 親本選擇對幼胚生長發(fā)育的影響

表2 取樣時期對離體胚珠培養(yǎng)生長發(fā)育的影響

表3 不同培養(yǎng)溫度對胚珠發(fā)育的影響

3 討論與結(jié)論

胚挽救技術(shù)是無核葡萄雜交育種的有效方法。不同無核品種自交，胚挽救難易程度差異很大，可能與不同無核品種種痕殘留程度有關(guān)，親本選擇對胚挽救效果影響顯著[10-13]。本研究表明，4種無核葡萄做親本，胚挽救由易到難順序為：奧迪亞無核、紅寶石無核、希姆勞特、無核白雞心，無核白雞心極難胚挽救成功，奧迪亞無核和紅寶石無核是胚挽救育種的好材料。接種時期是影響無核葡萄胚挽救的關(guān)鍵因素之一[9,14-17]，過早取樣胚發(fā)育不良，過晚取樣胚已經(jīng)敗育無法成苗，本試驗中無核葡萄胚珠發(fā)育率隨取樣時間的推移先增加后下降。普遍認(rèn)為不同雜交組合最佳取樣期不同，與本試驗研究相符。唐冬梅、徐海英等[6,9]均認(rèn)為胚珠發(fā)生敗育的時期與母本選擇密切相關(guān)，本試驗為以奧迪亞無核、紅寶石無核、希姆勞特為母本的胚挽救育種取樣期確定提供了依據(jù)。一般而言，低溫有助于打破種子的休眠，而對于從正生長發(fā)育的果實中獲得的胚珠來說，是否需要經(jīng)低溫處理打破休眠目前值得探討和研究[18-19]。郭修武等[20]認(rèn)為，低溫處理有利于胚發(fā)育，而唐冬梅[6]認(rèn)為，低溫對幼胚發(fā)育不利，本試驗結(jié)果與唐冬梅觀點一致。

本試驗結(jié)果表明：為提高胚挽救雜交育種效率，應(yīng)優(yōu)先選擇奧迪亞無核、紅寶石無核為親本；奧迪亞無核、希姆勞特為母本雜交胚珠選擇授粉后54 d取樣，紅寶石無核為母本雜交胚珠在授粉后61 d取樣；在25 ℃下進行胚發(fā)育培養(yǎng)比較合適。

[1] 王愛玲, 王躍進, 唐冬梅, 等. 提高無核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(20): 4238-4245.

[2] RAMMING D W, EMERSHAD R L. In-ovule embryo culture of seeded and seedless Vitis vinifera L[C]//Hortscience. 701 North Saint Asaph Street, Alexandria, Va 22314-1998: Amer Soc Horticultural Science, 1982, 17(3): 487.

[3] TIAN L L, WANG Y J, NIU L, et al. Breeding of disease-resistant seedless grapes using Chinese wild Vitis spp. I. In vitro embryo rescue and plant development[J]. Scientia Horticulturae, 2008, 117(2): 136-141.

[4] DHEKNEY S A, LI Z T, GRAY D J. Factors influencing induction and maintenance of Vitis rotundifolia Michx. embryogenic cultures[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2011, 105(2): 175-180.

[5] 閆愛玲, 孫 磊, 王慧玲, 等. 無核葡萄‘Kismis’胚挽救技術(shù)研究[J]. 中國果樹, 2016, 35(6): 29-31.

[6] 唐冬梅, 王躍進, 趙榮華, 等. 無核葡萄胚挽救中影響胚發(fā)育的因子[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(7): 2449-2457.

[7] 屈田田, 張劍俠, 駱強偉, 等. 無核葡萄抗寒抗病胚挽救育種應(yīng)用研究[J]. 果樹學(xué)報, 2017, 34(2): 157-165.

[8] 牛茹萱, 張劍俠, 王躍進, 等. 種子敗育型無核葡萄胚挽救研究[J]. 北方園藝, 2012(7): 1-5.

[9] 徐海英, 閻愛玲, 張國軍. 葡萄二倍體與四倍體品種間雜交胚珠的離體培養(yǎng)[J]. 果樹學(xué)報, 2001, 18(6): 317-320.

[10] POMMER C V, RAMMING D W, EMERSHAD R L. Influence of grape genotype, ripening season, seed trace size, and culture date on in ovule embryo development and plant formation[J]. Bragantia, 1995, 54(2): 237-249.

[11] GARCIA E, MARTINEZ A, GARCIA DE LA CALERA E, et al. In vitro culture of ovules and embryos of grape for the obtention of new seedless table grape cultivars[C]//VII International Symposium on Grapevine Genetics and Breeding 528. 1998, 663-666.

[12] 肖麗珍. 設(shè)施栽培無核葡萄胚珠、胚發(fā)育動態(tài)[J]. 中國林副特產(chǎn), 2012(4): 6-8.

[13] 杜萬濤, 郭印山, 王英. 三倍體葡萄胚挽救技術(shù)研究[J]. 北方果樹, 2012(2): 4-7.

[14] 王飛, 王躍進, 周會玲, 等. 無核葡萄與中國野生葡萄雜種胚發(fā)育和敗育的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報, 2005, 33(3): 61-65.

[15] 劉佳, 劉曉, 陳建, 等. 金星無核葡萄胚挽救影響因素的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2013, 26(1): 294-298.

[16] 郭印山, 郭修武, 張海娥, 等. 利用胚挽救技術(shù)獲得三倍體葡萄植株研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 36(5): 606-608.

[17] 牛茹萱, 張劍俠, 王躍進, 等. 種子敗育型無核葡萄胚挽救研究[J]. 北方園藝, 2012(7): 1-5.

[18] 王躍進, 張劍俠, 李桂榮. 采用胚挽救技術(shù)獲得抗病無核葡萄新材料的研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001, 36(9): 105-110.

[19] GALBRAITH D W, HARKINS K R, MADDOX J M, et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues[J]. Science, 1983, 220(4601): 1049-1051.

[20] 郭修武, 郭印山, 張海娥, 等. 接種時期和培養(yǎng)基對無核葡萄胚挽救的影響[J]. 園藝學(xué)報, 2007, 34(2): 329-332.

The studies on embryo rescue techniques of seedless grape selfing

TIAN Shufen1, WEN Xiaomin1,2, ZHANG Na1, YUE Ya1,2, LU Fengzhen1,2
（1. Tianjin Facility Agriculture Research Institute/Tianjin Enterprise Key Laboratory of Grape Genetics and Breeding, Tianjin 300192; 2. College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387）

Grape selfing ovules from of Otilia, Ruby Seedless, Himrod Seedless, and Centennial Seedless were used as materials. These ovules were cultured by embryo rescue. Factors including parents selection, sampling dates, development temperature were studied. The main results were as follows, parents selection had great influence on embryo rescue. Embryo development and germination rate from high to low was Otilia selfing, Ruby Seedless selfing, Himrod Seedless selfing, Centennial Seedless selfing. The optimal sampling dates varied among different varieties, the optimal sampling date were 54 days after bloom (DAB) in Otilia and Himrod Seedless selfing, 61 days(DAB) in Ruby Seedless, respectively. Percentages of embryo development in Otilia selfing and Ruby Seedless selfing were higher when embryos were cultured in 25℃. Low temperature would inhibit embryo development.

seedless grape; self-crossing; embryo rescue

S663.1

：A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.004

2017-06-10

天津市科技計劃項目（16ZXZYNC00160），天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金（15010）。

田淑芬（1966-），女，研究員，博士，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net