不同前處理方式對水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

李含晰，徐豐，石雪暉，劉昆玉，鐘曉紅*，楊國順

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/湖南省葡萄工程技術(shù)研究中心，長沙 410128）

不同前處理方式對水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

李含晰，徐豐，石雪暉，劉昆玉，鐘曉紅*，楊國順

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/湖南省葡萄工程技術(shù)研究中心，長沙 410128）

本文以水晶刺葡萄葉片和新梢為試驗材料，采用超聲波輔助提取白藜蘆醇，高效液相色譜（HPLC）法檢測其含量，并分別對烘干溫度、破碎度對其白藜蘆醇含量的影響進行研究。結(jié)果表明，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目，在此處理下，水晶刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達到6.22±0.34 μg/g，水晶刺葡萄新梢白藜蘆醇含量達到11.23±0.29 μg/g。

高效液相色譜法；水晶刺葡萄；白藜蘆醇；前處理

白藜蘆醇（Resveratrol）是植物次生代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇存在順反式異構(gòu)體，自然界中多存在反式白藜蘆醇[1]，比順式白藜蘆醇生物活性和藥理作用高。研究表明，白藜蘆醇具有降低血脂、降低粥動脈硬化、抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[2-4]。野生葡萄種質(zhì)資源刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.）的葉、新梢、果皮、酒渣中都含有大量白藜蘆醇[5-8]。在湖南省懷化市發(fā)現(xiàn)的水晶刺葡萄是刺葡萄的新類型[9]，該刺葡萄生物學(xué)性狀與普通刺葡萄有較大的差異，普通刺葡萄的果實都為紫黑色，而水晶刺葡萄的果實為白色。目前刺葡萄的研究多集中于種質(zhì)資源[10-12]、抗病性[13-14]、釀酒[15-16]等方面，功能成分方面也多集中于刺葡萄籽油和花色素的提取與利用[17-19]，而有關(guān)水晶刺葡萄白藜蘆醇前處理以及檢測方面的相關(guān)報道較少。本試驗以水晶刺葡萄修剪后的葉片、新梢為試驗材料，采用超聲波輔助提取白藜蘆醇，高效液相色譜檢測其含量，再分別對前處理中烘干溫度、粉碎度對白藜蘆醇含量的影響進行研究，為水晶刺葡萄修剪后的廢棄枝葉中白藜蘆醇的開發(fā)以及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

供試材料：試驗以水晶刺葡萄修剪后的葉片、新梢為材料，采摘于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄教學(xué)科研基地，基地采用“V”型架，株行距1.0 m×2.5 m，南北行向，2012年高接，砧木為紅地球，常規(guī)管理措施。

供試試劑：白藜蘆醇標準品（Aladdin公司，分析標準品）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；超純水。

試驗設(shè)備：Agilent 1260 LC高效液相色譜系統(tǒng)工作站，DAD檢測器；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱；高速萬能粉碎機；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器；電子分析天平；30目、40目、60目、100目標準篩。

1.2 方法

1.2.1供試樣品含水量測定

稱取修剪后的水晶刺葡萄葉片、新梢各200 g，清洗掉灰塵，平鋪在干燥鋁盤中，厚度適中，放入烘箱中烘干至樣品質(zhì)硬而脆、質(zhì)量不再改變。重復(fù)測定3次，取平均值，含水量計算公式如下：

式中：W1為新鮮樣品質(zhì)量（g）；W2為烘干樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2白藜蘆醇標準曲線繪制

稱取5.000 mg白藜蘆醇標準品于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇混勻，定容為200 μg/mL的白藜蘆醇標準品溶液。將白藜蘆醇標準品稀釋成5、10、20、40、80 μg/mL溶液進樣分析，以白藜蘆醇濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。

1.2.3供試樣品前處理工藝

（1）烘干溫度。分別稱取同一批修剪后的水晶刺葡萄葉片和新梢，分別放置在50 ℃、70 ℃、90 ℃條件下烘干至葉片和新梢質(zhì)硬而脆、質(zhì)量不再改變，記錄干燥時間，過40目標準篩備用，用超聲波輔助法提取白藜蘆醇。

（2）粉碎度。取90 ℃條件下烘干水晶刺葡萄葉片和新梢，粉碎處理，分別過30目、40目、60目、100目標準篩備用，采用超聲波輔助提取法進行白藜蘆醇的提取。

1.2.4水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇超聲波提取

準確稱取樣品粉末1.00 g，置于50 mL離心管中，加25 mL甲醇，封口避光超聲1 h，11000 r/min高速離心10 min，取上清液，定容至25 mL棕色容量瓶中。進樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即為待測樣品溶液。

1.2.5水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量檢測

參照楊星星[3]的HPLC檢測方法測定白藜蘆醇含量，并對檢測方法進行一定修改。色譜條件：（1）色譜柱：Agilent ZORBA SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；（2）流動相：水-乙腈，梯度洗脫程序：0～10 min，10%乙腈；10～20 min，20%乙腈；20～30 min，40%乙腈，30～35 min，85%乙腈；35～45 min，10%乙腈；（3）流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL，檢測波長：306 nm。各樣品重復(fù)處理6次，計算白藜蘆醇含量的平均值，白藜蘆醇含量計算公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計算得到的白藜蘆醇質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為提取溶液體積（mL）；W為所稱取樣品粉末質(zhì)量（g）。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗獲得數(shù)據(jù)運用Origin 8.0和SPSS 17.0版數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計和分析，白藜蘆醇含量的單位為：μg/g（以干重質(zhì)量計）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樣品含水量測定

新鮮水晶刺葡萄葉片含水量平行測定3次，得含水量78.00%、80.67%、81.33%，取平均含水量為80.00%。

新鮮水晶刺葡萄新梢含水量平行測定3次，得含水量72.40%、71.60%、71.60%，取平均含水量為71.87%。

2.2 白藜蘆醇標準曲線繪制

測定稀釋標準品白藜醇濃度，得到白藜蘆醇線性回歸方程為Y=173.89X+14.313，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，表明線性關(guān)系良好。信噪比（S/N）為3∶1時，得到白藜蘆醇質(zhì)量濃度最低檢出限為0.03 μg/mL。

將5 μg/mL的白藜蘆醇標準品溶液和水晶刺葡萄葉片、新梢供試樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，依次進樣，得到白藜蘆醇標準品溶液、水晶刺葡萄葉片、新梢供試樣品溶液（見圖1、圖2和圖3）的色譜圖，白藜蘆醇標準品溶液的保留時間為20.801 min，供試樣品溶液的保留時間20.840～20.945 min。

2.3 烘干溫度對水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

由表1可知，隨著烘干溫度的升高，烘干時間不斷縮短，白藜蘆醇含量也不斷提高。葉片在50～90 ℃溫度范圍內(nèi)隨著烘干溫度升高，烘干時間縮短，白藜蘆醇含量不斷增加。當(dāng)烘干溫度為90 ℃時，烘干時間最少，為4.7 h，比50 ℃所用的時間節(jié)省了3.06倍，白藜蘆醇含量達到最高，為6.22±0.34 μg/g，比50 ℃時的白藜蘆醇含量提高了3.51倍；新梢在50～90 ℃范圍內(nèi)隨著烘干溫度升高，白藜蘆醇含量快速提高，當(dāng)烘干溫度為90 ℃時，烘干時間最少，為8.7 h，比50℃時所用的時間節(jié)省了4.13倍，白藜蘆醇含量達到最高，為11.23±0.29 μg/g，比50℃時的白藜蘆醇含量提高了5.82倍。在50～90 ℃范圍內(nèi)，新梢的烘干時間始終比葉片所需的時間多，多了將近1倍，而新梢的白藜蘆醇含量始終比葉片高，這說明新梢白藜蘆醇含量比葉片含量相對較高。

2.4 粉碎度對水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

由表2可知，水晶刺葡萄供試品粉末粉碎度不同，白藜蘆醇含量也不同。水晶刺葡萄葉片粉末從30目到40目時隨著粉碎度增加，白藜蘆醇含量也增加，當(dāng)粉碎度為40目時，白藜蘆醇含量達到最高，為6.22±0.34 μg/g，而破碎度超過40目后，白藜蘆醇含量明顯減少；水晶刺葡萄新梢粉末從30目到40目時隨著粉碎度增加，白藜蘆醇含量也增加，當(dāng)粉碎度為40目時，白藜蘆醇含量達到最高，為11.23±0.29 μg/g，而破碎度超過40目后，白藜蘆醇含量有所減少。

綜上所述，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目。

圖1 反式-白藜蘆醇標準品色譜圖

3 討論與結(jié)論

在筆者前期試驗中，發(fā)現(xiàn)在水晶刺葡萄鮮葉中檢測不到白藜蘆醇，但在不同溫度烘干后，都有白藜蘆醇被檢測出，且不同烘干溫度對白藜蘆醇含量的影響較大，尤其是在90 ℃烘干溫度下，水晶刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達到6.22±0.34 μg/g，新梢中含量達到11.23±0.29 μg/g，這可能是離體后的樣品還具有生物活性，在受到非生物脅迫時（高溫），白藜蘆醇等次生代謝物合成加劇。謝紅旗等[20]的研究表明，中藥材的采后干燥過程，對于藥材來說是一個水分脅迫的過程，在這一過程中會啟動植物的抗旱應(yīng)激機制而導(dǎo)致某些次生代謝產(chǎn)物的量上升，本研究結(jié)果與此結(jié)論一致。還有可能是烘干溫度越高，烘干時間就越短，白藜蘆醇的降解時間也縮短。

圖2 水晶刺葡萄葉片中白藜蘆醇色譜圖

圖3 水晶刺葡萄新梢中白藜蘆醇色譜圖

水晶刺葡萄葉片的樣品粉碎度對白藜蘆醇含量的影響較大，通過粉碎可以將在薄壁細胞組織內(nèi)的白藜蘆醇釋放出來。粉碎度越大，樣品粉末越細，在相同的樣品質(zhì)量與溶劑體積條件下，粉末進樣量增加，即在一定范圍內(nèi)，隨著破碎度的增加，增大了粉末與提取溶劑的接觸面積，含量提高。但當(dāng)樣品過于粉碎，粉末目數(shù)增加到一定量時，固液分離的難度加大，過濾時濾渣中殘留的濾液量增多，損失加大，使含量反而下降，且粉末過細，提取出的雜質(zhì)也越多，不利于色譜檢測分析。本研究與王漫等[21]的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果較為一致。

不同前處理方式對水晶刺葡萄枝葉白藜蘆醇提取有較大影響。試驗結(jié)果表明，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目。在此處理下，刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達到6.22±0.34 μg/g，刺葡萄新梢白藜蘆醇含量達到11.23±0.29 μg/g。

表1烘干溫度對白藜蘆醇含量的影響

表2 粉碎度對白藜蘆醇含量的影響

[1] 張?zhí)m勝, 劉光明. 白藜蘆醇的研究概述[J]. 大理學(xué)院學(xué)報, 2007, 6(4): 72-74.

[2] 張瑞, 李永軍, 王鑫. 白藜蘆醇抗菌作用的研究進展[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 31(9): 1151-1153.

[3] 孟德平, 鄒志孟, 許曉群, 等. 白藜蘆醇對黑色素瘤細胞增殖的抑制作用[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2012, 19(5): 328-331.

[4] NDIAYE M, PHILIPPE C, MUKHTAR H, et al. The grape antioxidant resveratrol for skin disorders: Promise, prospects, and challenges[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2011, 508(2): 164-170.

[5] 鄧建平, 姜豐, 楊國順. 13個葡萄品種白藜蘆醇含量的研究[J].中國果菜, 2009(3): 45-46.

[6] 楊星星. 刺葡萄中白藜蘆醇及其衍生物的代謝積累與分離鑒定[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[7] 劉婷, 歐陽夢云, 王燕, 等. 刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2014, 30(6): 160-164.

[8] 鄭先波, 申炎龍, 史江莉. 中國野生葡萄果皮和葉片白藜蘆醇含量測定[J]. 果樹學(xué)報, 2016, 33(9): 1092-1102.

[9] 石雪暉, 楊國順, 倪建軍, 等. 刺葡萄新類型—水晶刺葡萄的生物學(xué)性狀研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2008(5): 60-62.

[10] 魏文娜, 王琦熔. 湖南野生葡萄資源調(diào)查及研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1991, 17(3): 447-451.

[11] 李潤唐, 魏文娜. 湖南三種野生葡萄的生物學(xué)特性及花粉形態(tài)研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2000(2): 102-104.

[12] 熊興耀, 王仁才, 孫武積, 等. 葡萄新品種‘紫秋’[J]. 園藝學(xué)報, 2006, 33(5): 1165.

[13] 劉昆玉, 方芳, 石雪暉, 等. 腺枝葡萄與刺葡萄對葡萄黑痘病和霜霉病的抗性[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 39(1): 46-51.

[14] 段慧. 刺葡萄對霜霉病和灰霉病的抗性機理初探[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[15] 周俊, 石雪暉, 秦丹, 等. 湖南刺葡萄釀酒試驗研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒. 2008(3): 14-15.

[16] 羅彬彬. 湖南刺葡萄酒降酸技術(shù)研究[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[17] 熊興耀, 歐陽建文, 劉東波, 等. 超臨界CO2萃取刺葡萄籽油及其成分分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2006, 32(4): 436-440.

[18] 潘小紅. 刺葡萄皮色素的提取工藝及應(yīng)用研究[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[19] 胡楠. 刺葡萄籽油微膠囊化的研究[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[20] 謝紅旗, 楊星星, 曾建國, 等. 不同前處理方式對鮮葡萄枝蔓中茋類化合物的影響研究[J]. 中草藥, 2014, 45(24): 3553-3558.

[21] 王漫, 穆立薔, 周智博, 等. 不同前處理方式對沙棗業(yè)總黃酮提取的影響[J]. 中國釀造, 2013, 32(10): 102-105.

The influences of different pretreatment methods on the resveratrol contents of young sprouts and leaves in Vitis davidii Fo?x Shuijing

LI Hanxi, XU Feng, SHI Xuehui, LIU Kunyu, ZHONG Xiaohong*, YANG Guoshun
(Horticulture and Landscape College of Hunan Agricultural University/Hunan Engineering Technology Research Center for Grape, Changsha 410128)

In this paper, ultrasonic-assisted method were used to extract resveratrol from leaves and yound sprouts of Vitis davidii Fo?x Shuijing respectively, to determine the resveratrol content by HPLC method. The influences of different drying temperature and degree of aperture on the content of resveratrol and the content variation of resveratrol in leaves and young sprouts of Vitis davidii Fo?x Shuijing were investigated. The results showed that the optimum drying temperature and degree of fragmentation were 90 ℃ and 40 meshes respectively, in which the content of resveratrol in leaves reached 6.22±0.34 μg/g, the content of resveratrol in young sprouts reached 11.03±0.29 μg/g.

HPLC; Vitis davidii Fo?x Shuijing; resveratrol; pretreatment method

S663.1

：A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.006

2017-06-06

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（cx2013B291）

李含晰（1992-），女，碩士研究生，主要從事葡萄功能成分研究。E-mail: 2686863245@qq.com

*通訊作者：鐘曉紅，女，教授，E-mail: xh-zhong@163.com