論酒精發酵中酵母菌的有效活化與營養管理

都振江，徐金輝，曹明秀*

（1. 中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司，山東蓬萊 265608；2. 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工貿有限公司，上海 200120）

論酒精發酵中酵母菌的有效活化與營養管理

都振江1，徐金輝2，曹明秀3*

（1. 中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司，山東蓬萊 265608；2. 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工貿有限公司，上海 200120）

本文通過大量的研究案例和成果，深入論述了酵母的活化保護及營養管理的重要性及其對酒精發酵的貢獻。在酵母活化復水時應用專業活化保護劑Goferm Protect，可以補充大量甾醇類，強化酵母菌細胞膜，顯著增強其生存能力，降低死亡率。在酒精發酵1/3階段，使用有機營養劑Fermaid O，相比使用單純的無機氮源DAP，不僅能夠提高發酵速率，縮短發酵時間，而且顯著提升了葡萄酒的感官品質。

酒精發酵；酵母菌；活化保護劑；營養

在葡萄酒釀造中，酵母面臨滲透壓、長時間處于不斷上升的乙醇酒汁中、自生菌的競爭、培養基的酸度以及營養物質缺乏等環境限制[1]。酵母菌應對不同的環境脅迫有多種反應機制：細胞內累積甘油以應對外界高滲透壓；排出質子以調節pH；胞內排出乙醇；釋放嗜殺型毒素以抵抗自生菌污染等。然而一旦環境中的限制因素作用時間長并不斷加強時，有機體必須調動能量和資源來應對挑戰，同時，防御系統越來越弱，對外界的刺激越來越敏感，直至死亡。具體到酒精發酵中，會引起發酵偏差或緩慢，酒汁感官品質差，甚至會造成發酵停滯。因此，對酵母菌進行有效活化和營養管理是保障酒精發酵順利進行的關鍵工藝點。

1 酵母的選用及有效活化

生物個體對環境的反應能力是不同的，例如不同酵母的耐酒精能力也不同，因此，針對糖度較高的葡萄酒汁發酵，通常會選用耐酒精的經典款酵母BDX、D254、Clos、DV10、EC1118、L2226及L2323等[2]。

為了抵制發酵惡劣環境，可以在酵母活化時為酵母添加一層甾醇，強化酵母細胞膜，提高在困難環境中的生存能力。在一定條件下，酵母自身在氧氣參與的條件下可以合成甾醇，但是過多的氧氣會給酵母帶來不穩定的甾醇。在酵母復水活化階段，酵母菌能將復水活化液中的甾醇加入到自身細胞膜上。研究發現，經Goferm Protect活化保護的酵母細胞膜在電鏡下觀察明顯比未經處理組厚實[3-4]。

在酒精發酵過程中，高糖、高酸、高澄清或缺氧的環境對酵母的影響是非常顯著的。圖1顯示了三種酵母在酒精發酵完成后死亡細胞數量的變化[3-4]。由圖1可以觀察到，三種酵母菌株DV10、KD和58W3在添加活化保護劑Goferm Protect后，均顯著的增強自身生存能力，空白組的死亡率明顯高于Goferm Protect組。試驗也證實營養劑在發酵動力學和感官方面有非常積極的影響，而對酵母存活率沒有直接影響。因此，使用專業酵母活化保護劑能夠使酵母更強地抵抗含有酒精和其他毒素等基質脅迫和壓力，顯著降低感官偏差的風險。

2 全面平衡的營養

抵抗環境脅迫存活下來只是酵母的第一道關卡，如何在酒精發酵中更好的表現出其品質也是同樣重要的。葡萄汁中平衡充足的營養物質是酵母順利完成發酵的前提條件，這些主要的營養物質包括：酵母可同化利用氮、礦物質、維生素等[5]。

2.1 氮源

葡萄汁中的氮以不同的形式存在：蛋白質、多肽、銨離子（NH4+）和其他α-氨基酸。酵母可同化利用氮由銨離子和除脯氨酸以外的α-氨基酸組成。純天然葡萄汁中的可同化吸收利用氮濃度在60～500 mg/L之間，根據葡萄的品種、年份以及微氣候略有不同。通常情況下，天然葡萄汁中的可同化利用氮是缺乏的。可同化利用氮能夠被酵母吸收利用合成蛋白質，保障自身繁殖，對發酵動力學也有重要影響。酵母前期的自身繁殖會消耗大量的可同化利用氮，后期氮水平降低，酵母的蛋白合成和糖轉運功能降低，此時加入外源可同化利用氮將提高發酵速率，縮短發酵時間。

廣泛的研究發現，氮的最佳添加時間是1/3酒精發酵階段（當酵母數量達到最大值時），此時葡萄汁中的氮消耗殆盡[6]。在酒精發酵開始時應控制無機氮源的大量存在，否則會導致酵母大量快速繁殖，氮被大量消耗的同時會產生過多的熱量，從而不會有多余的氮供酵母消耗將糖轉化為酒精。如果是有機氮源，可以在酒精發酵開始時添加，并在1/3階段補加。因為可同化吸收氮中的氨基酸態氮（有機氮）和銨離子氮（無機氮）吸收利用方式是不同的。氨基酸通過主動運輸的方式進入細胞累積，能夠被直接利用合成蛋白質，降解為NH4+或者轉化為谷氨酸。這種吸收利用方式相比無機氮的利用緩慢、穩定而有效，而NH4+直接被酵母消耗掉而未必有益。

圖1 Goferm Protect對酵母存活率的影響

2.1.1氨基酸對酵母酯類物質產量的影響

葡萄汁中的氨基酸組成及含量對葡萄酒的香氣感官有重要影響，換句話說，發酵中氨基酸的含量影響著酒精和酯類物質的生成。在新疆霞多麗葡萄汁中分別添加無機氮源DAP、有機營養劑包（Fermaid O）和營養劑組合（DAP和Fermaid O）進行發酵對比，圖2顯示了部分試驗結果，添加與DAP相同含量可同化利用氮（50 mg/L）的復合營養劑，各種酯類化合物均有不同程度的增加；而添加24 mg/L的有機營養劑包Fermaid O的處理中多種酯類化合物均顯著增加[6-7]。可以得出結論：等量的可同化利用氮（YAN），含有部分氨基酸態氮的營養劑更能促進酯類化合物的生成；而相比營養劑組合，完全有機營養劑包Fermaid O（即使可同化利用氮含量低，但氨基酸含量更高）更能夠顯著提升酯類物質產量。

圖2 DAP和Fermaid O含量對酯類物質產量的影響（2014霞多麗，中國新疆）

2.1.2不同氮源對硫醇物質產量的影響

硫醇化合物的生成也與氮的代謝有關。研究發現，發酵中過多的銨離子（無機氮）或在開始發酵時添加過多的銨離子（無機氮）會限制酵母對葡萄品種香氣硫醇物質的釋放[8]。這種現象可被解釋為代謝阻遏，銨離子阻斷了酵母氨基酸的合成和轉運，進而限制硫醇前體物質半胱氨酸進入細胞，最終使細胞內合成不穩定易分解的硫醇。在新疆赤霞珠葡萄上試驗顯示（圖3），當發酵中使用無機氮源DAP時，硫醇物質3-MH和3-MHA產量明顯降低[6-7]。另一個試驗（圖4）是對法國羅納河谷的鴿籠白葡萄酒精發酵開始時和1/3酒精發酵階段分別添加兩種不同的有機營養劑進行發酵，可以發現，兩種有機營養劑對3-MH和3-MHA的產出均有積極作用，能夠促進硫醇物質的轉化和釋放[6-7]。

2.1.3有機營養劑對葡萄酒感官品質的影響

酯類物質和硫醇類物質是葡萄酒中的主要香氣成分，酯類和硫醇產量的增加必將提升葡萄酒的香氣品質。通過大量的感官試驗對比，有機營養劑和無機氮源營養劑的應用效果（圖5）有顯著差別，而且，有機營養在發酵中的應用對葡萄酒最終的感官品質具有非常積極的影響，所釀酒品深受專業品酒者的喜愛，口感更復雜，香氣更濃郁和持久[6-7]。

圖3 DAP對3-MH和3-MHA產量的影響

2.2 礦物質

葡萄汁中礦物質的生物利用率通常很低，因其經常和葡萄汁中的其他成分（如蛋白質和多酚）結合。過熟的葡萄礦物質含量更低，而被真菌感染的葡萄會被消耗掉大量礦物質。土壤類型和栽培管理對礦物質含量也有重要影響。此外，葡萄中各種礦物質之間的平衡也很重要，研究發現過多的鈣會抑制鎂的正常吸收。酵母細胞對鎂需求高，因為鎂參與一些酶的激活，在糖酵解途徑中，對酵母的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性起著重要作用；鎂穩定細胞膜結構，在抵抗酒精滲透壓方面也有重要作用，有限的鎂會限制酵母的生長和發酵活度。有研究顯示，鉀素缺乏會影響酵母細胞存活率，尤其在低pH環境中容易引起發酵停滯[9]。因此，補足豐富多樣的礦物質對酒精發酵具有積極作用。

2.3 維生素

生物素是維生素的一種，對發酵中酯類物質的產生和酵母細胞的活力有重要作用。當生物素缺乏時，會顯著影響酵母細胞生長。泛酸（維生素B5）幫助避免H2S和揮發酸的產生。硫胺素（維生素B1）對發酵速率有重要影響，缺乏容易引起發酵停滯，供應充足能夠增進酵母細胞數量和發酵速率[10]。在發酵初期，大多數葡萄汁含有酵母需要的部分主要維生素，但是變化很快。例如硫胺素和生物素在發酵的第一個階段很快被消耗掉，如果硫胺素和SO2的結合則不能被酵母利用。在預發酵階段，野生菌也會消耗大部分的主要維生素。因此，補足維生素的極其重要。

圖5 有機營養劑對葡萄酒感官品質的影響（2012維歐尼，法國羅納河谷）

表1 活化保護劑及發酵營養劑各種主要成分分析

3 活化保護劑及發酵營養劑的主要成分

表1列出了添加量0.30 g/L的Goferm Protect、Fermaid E、Fermaid O以及DAP的各種重要因子或營養成分和可同化利用氮含量。Goferm Protect是一種酵母活化保護劑，其主要成分為甾醇，在酵母復水活化時添加，可強化酵母細胞膜，顯著增強細胞生存能力，降低其死亡率。雖然Goferm Protect也含有部分營養物質（氨基酸、維生素、礦物質），但其不能替代發酵營養助劑。DAP只是簡單的無機氮源，而沒有其他營養物質，如果葡萄汁只是簡單的氮缺乏，可以在1/3酒精發酵階段適當補充。Fermaid O是完全有機發酵全營養包，富含多種有機營養（特別是氨基酸），對葡萄酒的感官品質有重要影響。Fermaid E是一種復合發酵全營養包，是無機氮源和有機全營養包的組合，氨基酸含量較Fermaid O略低。

4 小結

保障酒精發酵質量水平的第一個關鍵工藝點，就是對酵母的復水活化與保護。專業活化保護劑Goferm Protect的應用，為酵母補充甾醇而強化其細胞膜，顯著增強其生存能力和健康活力，提高接種酵母的活化率。

天然葡萄汁中的營養物質通常是缺乏和不均衡的，并且在酒精發酵開始時易被酵母快速消耗殆盡以滿足其細胞增殖。在酒精發酵啟動及1/3階段及時補充有機營養包Fermaid O或復合全營養包 Fermaid E，使葡萄汁中均衡且富含酵母所需各種重要有機營養物（氨基酸、維生素、礦物質）。不僅能夠提高發酵穩定性和水平，縮短發酵時間，而且能夠促進酯類和硫醇物質的生成，保障口感細膩，從而顯著提升葡萄酒的感官品質。

[1] 徐國強, 杜婕, 吳滿珍, 等. 酒精發酵過程中釀酒酵母耐受環境脅迫的研究進展[J]. 微生物學雜志, 2013(6): 80-83.

[2] 俞惠明, 曹明秀. 淺談炎熱氣候條件下葡萄收獲時間及釀酒方案的選擇[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2017(2): 57-60.

[3] The state of the art. Yeast nutrition and protection for good alcoholic fermentation[EB/OL]. [2017-06-05]. http://www.vawa.net/ winemaking-articles/Lallemand%20Yeast%20Nutrition.pdf.

[4] Goferm protect detail[EB/OL]. [2017-06-04]. http://www. lallemandwine.com/ australia-new-zealand/ products/catalogue/ product-detail/6/nutrient-protectors/4/goferm-protect/.

[5] 李雪霞, 秦曉媛, 雷順新. 葡萄汁生產及研究現狀[J]. 輕工科技, 2010, 26(2): 1-3.

[6] The wine expert. The many roles of nitrogen in alcoholic fermentation[R/OL]. [2017-06-05]. http://www.lallemandwine.com/ wp-content/uploads/2015/08/WE8-Nitrogen.pdf.

[7] ORTIZ-JULIEN A, DUMONT A, LORDAT E, et al. Nitrogen plays many roles during fermentation uncovering the relationship between nitrogen and aroma development[J].Wine & Vines, 2016(1): 117-121.

[8] SUBILEAU M, SCHNEIDER R, SALMON J M, et al. New insights on 3-mercaptohexanol (3MH) biogenesis in Sauvignon Blanc wines: Cys-3MH and (E)-hexen-2-al are not the major precursors[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 56(19): 9230-9235.

[9] KUDO M, VAGNOLI P, BISSON L F. Imbalance of pH and potassium concentration as a cause of stuck fermentations[J]. American Journal of Enology & Viticulture, 1998, 49(3): 295-301.

[10] BATAILLON M, RICO A, SABLAYROLLES J M, et al. Early thiamin assimilation by yeasts under enological conditions: Impact on alcoholic fermentation kinetics[J]. Journal of Fermentation & Bioengineering, 1996, 82(2): 145-150.

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.030

2017-06-11

都振江，男，工程碩士，高級工程師，國家葡果酒評委，長期從事葡萄與葡萄酒的技術與管理工作。

*通訊作者：曹明秀（1991-），女，工學碩士學位，研究方向食品科學。E-mail: cmingxiu@jatou.com