槐杞黃顆粒對MRL/Lpr狼瘡腎小鼠Th17細胞的影響及機制研究

汪衛(wèi) 于健寧 陶筱娟

槐杞黃顆粒對MRL/Lpr狼瘡腎小鼠Th17細胞的影響及機制研究

汪衛(wèi) 于健寧 陶筱娟

目的探討槐杞黃顆粒對MRL/Lpr狼瘡腎小鼠Th17細胞的影響以及相關機制。方法正常飼養(yǎng)C57BL/6小鼠8只為空白對照組，8～10周齡MRL/Lpr狼瘡小鼠24只，隨機分為模型組、槐杞黃顆粒治療組和地塞米松治療組，每組8只。MRL/Lpr狼瘡小鼠12周齡左右開始發(fā)病，分別給予槐杞黃顆粒或地塞米松治療，檢測各組處理前后24h尿蛋白定量，血清TGF-β、IL-17含量，腎臟RORC mRNA表達水平。結果與模型組比較，地塞米松組和槐杞黃組小鼠治療后尿蛋白含量明顯下降[（245.87±47.25）mg/L、（333.18±22.19）mg/L比（474.69±48.76）mg/L，P＜0.05]；與空白組比較，地塞米松組、槐杞黃組TGF-β和IL-17均升高[TGF-β：（262.69±23.53）ng/L、（352.05±26.77）ng/L比（166.12±36.44）ng/L，P＜0.01；IL-17：（265.25±44.29）pg/mL、（317.33±46.83）pg/mL比（172.03±45.21）pg/mL，P＜0.05，P＜0.01]；與模型組比較，地塞米松組、槐杞黃組TGF-β和IL-17明顯降低[TGF-β：（262.69±23.53）ng/L、（352.05±26.77）ng/L比（593.84±35.02）ng/L，P＜0.01；IL-17：（265.25±44.29）pg/ mL、（317.33±46.83）pg/mL比（602.13±58.30）pg/mL，P＜0.01]；與空白組比較，模型組腎臟Th17細胞比例和細胞數、RORC mRNA表達量顯著上升[Th17比例：（8.62±0.77）%比（0.05±0.02）%，P＜0.01；Th17細胞數：（8.62±0.77）104/mL比（0.05±0.02）104/mL，P＜0.01；RORC mRNA：（11.08±0.89）比（1.00±0.05），P＜0.01]；與模型組比較，地塞米松組、槐杞黃組腎臟Th17細胞比例和細胞數、RORC mRNA表達顯著下降[Th17比例：（0.15±0.04）%、（4.06±0.43）%比（8.62±0.77）%，P＜0.01；Th17細胞數：（0.15±0.04）104/mL、（4.06±0.43）104/mL比（8.62±0.77）104/mL，P＜0.01；RORC mRNA：（3.67± 0.39）、（5.53±0.49）比（11.08±0.89），P＜0.01]。結論槐杞黃顆粒能減少狼瘡腎小鼠尿蛋白排出，調節(jié)Th17細胞分化，其機制可能與下調RORCmRNA表達有關。

MRL/Lpr狼瘡小鼠；系統性紅斑狼瘡；槐杞黃；地塞米松；腎損傷；Th17細胞

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見而復雜的自身免疫性疾病，主要是因免疫耐受失衡導致的T細胞應答失調和B淋巴細胞功能亢進，使體內產生和沉積多種自身抗體和免疫復合物，從而引起組織損傷[1]。研究表明，Th17細胞數量和/或功能異常與SLE發(fā)生、發(fā)展密切相關[2-5]。Th17是一種重要的促炎性細胞，參與自身免疫性疾病，也是其主要致病性細胞[5-6]。TGF-β、IL-6和IL-23可促進Th17細胞的分化發(fā)育[7]。槐杞黃顆粒是由槐耳菌絲、枸杞子、黃精制成的顆粒劑，具有益氣養(yǎng)陰功效。槐杞黃的主要有效成分槐耳富含PS-T（槐耳菌質多糖），已證實PS-T可明顯增強機體細胞免疫應答，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等功能[8]。槐耳菌還能誘生免疫調節(jié)劑—TH1類細胞因子[9-10]。目前SLE無特異性的治療方法。槐杞黃顆粒在系統性紅斑狼瘡的研究尚無文獻報道，其機制也不清楚。本文通過MRL/Lpr狼瘡小鼠模型，研究槐杞黃顆粒是否是通過其對Th17的調節(jié)從而起到改善狼瘡小鼠腎損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級MRL/lpr自發(fā)系統性紅斑狼瘡狼瘡樣模型小鼠24只，正常C57BL/6小鼠8只，雌性8～10周齡，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，由國家遺傳工程小鼠資源庫暨南京大學模式動物研究所提供，實驗動物許可證號：SYXK（粵）2008—0002。環(huán)境溫度穩(wěn)定于20～26℃，濕度40%～70%，采用10h：14h晝夜自動循環(huán)交替照明。

1.2 藥物及試劑槐杞黃顆粒購自蓋天力藥業(yè)有限公司，地塞米松購自Sigma，TGF-β、IL-17試劑盒購自慧嘉生物科技有限公司，FITC標記山羊抗小鼠lgG（H+L）購自碧云天公司（批號A0568），IgG單抗購自Abcam（批號Ab6785），C3單抗購自Santa cruz（批號Sc-28294），Anti-Mouse CD3 APC購自Biole-gend（批號100235），Anti-Mouse CD8 PE購自Bio-legend（批號100707），Anti-Mouse/Rat IL-17A FITC購自Ebioscience（批號11-7177-80），胎牛血清購自GIBCO（批號16000-044），RMPI-1640購自Hyclone（批號SH30809.01B），PMA購自Sigma（P1585），鈣離子霉素購自Solarbio（18800-1mg），Monensin（蛋白轉運抑制劑）購自Beyotime（CAS22373-78-0）。

1.3 儀器Thermo公司Multiskan MK3型全自動酶標儀，Leica公司DM6000B型熒光顯微鏡，BD公司Accuri C6型流式細胞儀（flow cytometry，FCM），IMS圖象分析系統，ABI 7300 Real-time PCR儀器。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥24只MRL/Lpr狼瘡小鼠，按隨機數字表法隨機分為槐杞黃組、地塞米松組和模型組，各8只。正常C57BL/6小鼠8只為空白對照組。MRL/Lpr狼瘡小鼠12周齡左右開始發(fā)病，槐杞黃組予槐杞黃顆粒4g/kg灌胃，每天1次；地塞米松組予地塞米松2.5mg/kg灌胃，每天1次；模型組給予生理鹽水灌胃，每天1次。各組均連續(xù)灌胃15天。

1.4.2 24h尿蛋白檢測考馬斯亮藍（CBB法）檢測24h尿蛋白，G250具有紅色和青色兩種色調，在游離狀態(tài)下，呈紅色型，一旦與蛋白質結合即變?yōu)榍嗌氐淖畲笪詹ㄩL從465nm轉移到595nm。測定595nm處光密度值，即可進行定量。按照試劑盒說明書進行操作。

表1 RT-PCR引物

1.4.3 用酶聯免疫吸附法（Elisa）測定血清TGF-β、IL-17含量各組小鼠灌胃結束后，摘取眼球法取各組小鼠外周血，室溫血液自然凝固10～20min，離心20min左右（2000～3000rpm/min），仔細收集上清，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 腎單核細胞懸液制備采用頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精中浸泡10～15min；無菌分離腎臟，放入PBS溶液中清洗2遍；然后加入適量培養(yǎng)基；將剪碎后的組織經200目濾網過濾，得到腎細胞懸液；加入與細胞懸液等量體積的淋巴細胞分離液，之后將細胞懸液輕輕加到離心管的淋巴細胞分離液上層；離心完畢后吸取中間白膜層即為單個核細胞；培養(yǎng)基進行洗滌1次后，用紅細胞裂解液去除紅細胞；再次用培養(yǎng)基進行洗滌1次，重懸后進行細胞計數；調整細胞濃度為1×106/mL，接種于24孔板中，加入PMA300ng/mL，200μL和離子霉素1μg/mL，加入RMPI-1640至1000μL充分混勻后，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，取出后加入濃度為2μmol/L的蛋白質轉運抑制劑莫能菌素200μL，之后放入37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h；buffer洗滌之后離心棄上清，沉淀用buffer重懸。

1.4.5 Th17細胞檢測單核細胞計數后調整細胞濃度為106/mL。設置14個檢測管：陰性對照管；同型對照管；CD3單標管；CD8單標管；IL-17單標管；CD3和CD8雙標管；CD3+CD8+IL-17三標管；4℃避光孵育1～2h。IL-17單標管和CD3+CD8+IL-17三標管進行3000rpm,10min離心，棄上清，沉淀用PBS溶液洗滌2次，洗滌后的細胞沉淀用0.5mL FIX buffer重懸，放置4℃固定30min；其他檢測管可進行上機檢測；固定結束后，IL-17單標管和CD3+CD8+IL-17三標管每管分別用0.5mL Permeabilization and Wash buffer洗滌兩次；洗滌結束后，IL-17單標管和CD3+ CD8+IL-17三標管每管分別加入0.5mL Permeabilization and Wash buffer，放置4℃破膜30min；破膜后，IL-17單標管和CD3+CD8+IL-17三標管每管分別加入IL-17抗體5μL；4℃避光孵育1h。流式細胞儀上機檢測。

1.4.6 RT-PCR檢測細胞總RNA提取后消除總RNA中的DNA，然后進行反轉錄。反應程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。Realtime PCR擴增反應體系：12.5μL SYBRGreen Mix，0.5μL上游引物F，0.5μL下游引物R，2μL cDNA模板，總體積25μL；反應程序：95℃，10min；（95℃，15s；60℃，45s）×40；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s；數據結果采用ABI Prism 7300 SDS Software儀器軟件分析，結果數據采用2-△△CT法進行分析。引物序列見表1。

1.4.7 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均值±標準差（） 表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）LSD法（最小顯著性法），P＜0.05為差異有統計學意義，并采用GraphPad Prism 6軟件對結果繪制圖。

2 結果

2.1 各組小鼠治療前后24h尿蛋白定量比較空白對照組、模型組治療前后尿蛋白含量無顯著變化（P＞0.05）；地塞米松組、槐杞黃組小鼠治療后尿蛋白含量明顯下降（P＜0.01，P＜0.05）；地塞米松組、槐杞黃組小鼠治療后尿蛋白含量明顯低于模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠治療前后24h尿蛋白含量比較（mg/L，）

表2 各組小鼠治療前后24h尿蛋白含量比較（mg/L，）

注：與治療前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別空白組模型組地塞米松組槐杞黃組鼠數8 8 8 8治療前184.66±18.40 407.45±79.50 459.63±31.62 451.60±66.44治療后170.61±25.07 474.69±48.76 245.87±47.25▲▲△333.18±22.19▲△

2.2 各組小鼠血清TGF-β、IL-17含量比較與空白組比較，模型組、地塞米松組、槐杞黃組小鼠血清TGF-β、IL-17含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、槐杞黃組小鼠血清TGF-β、IL-17含量顯著降低（P＜0.01），見表3。

表3 各組小鼠血清TGF-β、IL-17含量比較（）

表3 各組小鼠血清TGF-β、IL-17含量比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別空白組模型組地塞米松組槐杞黃組鼠數8 8 8 8 TGF-β（ng/L）166.12±36.44 593.84±35.02** 262.69±23.53**△△352.05±26.77**△△IL-17（pg/mL）172.03±45.21 602.13±58.30** 265.25±44.29*△△317.33±46.83**△△

2.3 各組小鼠腎臟Th17細胞比例及細胞數比較與空白組比較，模型組小鼠腎臟Th17細胞比例和細胞數顯著上升（P＜0.01）；經地塞米松和槐杞黃顆粒治療后，狼瘡小鼠腎臟Th17細胞比例和細胞數顯著下降（P＜0.01）。見圖1～2。

2.4 各組小鼠腎臟RORC mRNA表達與空白組比較，模型組狼瘡小鼠腎臟單核細胞維甲酸相關孤兒受體（retinoic acid related orphan receptor，RORC）mRNA表達量顯著上升（P＜0.01）；經地塞米松和槐杞黃顆粒治療后，狼瘡小鼠腎臟單核細胞RORC mRNA表達顯著下調（P＜0.01），見圖3。

3 討論

SLE確切的病因及發(fā)病機制尚不十分清楚。研究[11]表明，CD4+T細胞在SLE自身免疫反應以及器官損害方面發(fā)揮重要作用。調節(jié)性T（regulatory cells，Treg）細胞和Th17細胞作為特殊的T細胞亞群，其失衡在SLE的發(fā)病機制中起到重要的作用。實驗[12]證明，Treg細胞和Th17細胞失衡與自身免疫性疾病特別是SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關。Treg細胞在體內外都具有免疫抑制功能，能夠控制免疫應答的強度，減輕對機體組織損傷。Treg細胞通過抑制效應T細胞的活化增殖達到機體的免疫耐受和預防自身免疫性疾病的作。Th17細胞被認為是一群重要的介導炎癥反應的細胞，是一種特定的CD4+T細胞亞群，主要是分泌促炎因子IL-17[12]。同時也可分泌其他細胞因子如IL-17F、IL-21、IL-22、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等。IL-17主要是通過促進中性粒細胞聚集，誘導細胞釋放前炎癥因子，在宿主抗細菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。而IL-17的表達異常與慢性炎性疾病、自身免疫性疾病有著密切的關聯[13]。

圖1 各組小鼠腎臟Th17細胞流式檢測結果（CD4+IL-17+標記Th17細胞）

圖2 各組腎臟中Th17細胞比例及細胞數

圖3 各組小鼠腎臟單核細胞RORC mRNA轉錄水平

近年研究表明，Th17細胞在SLE的致病過程中發(fā)揮重要作用。在狼瘡小鼠模型中已證實，Th17細胞與狼瘡的發(fā)生密切相關。Stanus等[14]在BXD2狼瘡小鼠模型中研究發(fā)現，脾Th17細胞數目均異常升高，分離的初始CD4+T細胞在體外培養(yǎng)中更易于分化為Th17細胞。2000年Wong等[15]報道，華人SLE患者的外周血Th17細胞明顯升高，并和SLE疾病活動性指數（SLEDAI）之間呈正相關。Ambrosi等[16]報道，在狼瘡鼠模型和SLE患者中的研究表明Th17細胞通過分泌前炎性因子IL-l7使其在推動疾病的進程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過對MRL/lpr自發(fā)系統性紅斑狼瘡模型研究發(fā)現，模型組小鼠24h尿蛋白定量下降，提示HQH能減少狼瘡小鼠蛋白尿的排除；相比空白對照組，模型組小鼠血清TGF-β、IL-17含量都顯著上升（P＜0.001）；經地塞米松及槐杞黃顆粒治療后，小鼠血清TGF-β、IL-17含量不同程度下調（P＜0.01）。說明槐杞黃顆粒能抑制MRL/lpr自發(fā)系統性紅斑狼瘡小鼠TGF-β表達，從而使得初始CD4+T細胞不向Th17細胞分化，轉而向調節(jié)性T細胞分化成為可能。同時地塞米松及槐杞黃顆粒治療后，小鼠血清IL-17下降，也證實CD4+T細胞向Th17分化減少。各組腎臟Th17細胞檢測結果顯示，相比正常組小鼠，未治療狼瘡小鼠腎臟中Th17細胞比例和細胞數顯著上升（P＜0.01）；經地塞米松和槐杞黃顆粒治療后，狼瘡小鼠腎臟Th17細胞比例和細胞數顯著下降（P＜0.01）。進一步證實，槐杞黃顆粒通過抑制TGF-β的表達，從而減少CD4+T細胞向Th17細胞分化，使得Th17細胞比例減少，降低SLE疾病活動性指數（SLEDAI），減緩SLE的發(fā)生。本研究也與武青等[17]的研究結果一致[18]。

維甲酸相關孤兒受體是Th17細胞的特異性轉錄因子，調控著Th17細胞的分化和發(fā)育[18-19]，控制Th17細胞效應性細胞因子IL-17的表達。Th17細胞分泌的最主要細胞因子是IL-17A，在初始T細胞內轉入編碼RORC的逆轉錄病毒可誘導Th17細胞分泌IL-17。研究表明，當小鼠敲除RORC基因后，IL-17表達下降[19-20]，Th17細胞數量也相應減少[19]。另外，Th17與Treg細胞的分化成熟分別受其上游轉錄因子RORC及Foxp3基因表達水平調控[21]。初始T細胞在IL-6、TGF-β以及轉錄因子RORC的參與下能夠被誘導分化成Th17細胞[22]。本研究結果表明，狼瘡小鼠腎臟單核細胞RORC mRNA表達量較空白對照組小鼠顯著上升（P＜0.01）；經地塞米松和槐杞黃顆粒治療后，狼瘡小鼠腎臟單核細胞中RORC mRNA的表達顯著下調（P＜0.01）。說明槐杞黃顆粒可以通過抑制RORC表達，從而降低其對CD4+T向Th17的分化趨勢，使得Th17細胞減少，從而起到對SLE的治療作用。

綜上所述，槐杞黃顆粒可以抑制TGF-β和RORC表達，同時抑制TGF-β和IL-6聯合誘導的Th17細胞的分化趨勢，降低Th17細胞比例，減少IL-17表達，減緩SLE的發(fā)生，減輕MRL/lpr自發(fā)系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟損害，對系統性紅斑狼起到一定的治療和緩解作用。

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（收稿：2017-05-06 修回：2017-05-16）

Effect of Huaiqihuang Granule on Th17 Cells of MRL/Lpr Mice with Lupus Nephritis and Its Underlying Mechanisms

WANG Wei,YU jianning,TAO xiaojuan.Department of Rheumatology,Immune&Nephrology,

Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the effect of Huaiqihuang（HQH）on Th17 cells of MRL/Lpr mice with lupus nephritis.MethodsEight normal 8-10 weeks C57BL/6 mice were fed as blank control group.MRL/Lpr lupus erythematosus mice were randomly arranged to three groups∶model group,HQH treated group,dexamethasone（DXM）treated group.After the appearance of clinical symptoms at 12 weeks age,Mrl/lpr mice were treated with HQH or dexamethasone.The levels of 24h urine protein quantitation,TGF-β,IL-17,and RORC mRNA and the proportion of TH17 in CD4+T cells of each group were detected before and after treatment.ResultsAfter treatment compared with model group,DXM group and HQH group had decreased 24h urinary protein content（245.87± 47.25mg/L and 333.18±22.19mg/L vs 474.69±48.76mg/L,P＜0.05）;compared with blank group,DXM and HQH groups had increased TGF-β and IL-17（TGF-β∶262.69±23.53ng/L and 352.05±26.77ng/L vs 166.12±36.44ng/L,P＜0.01;IL-17∶265.25±44.29pg/mL and 317.33±46.83pg/mL vs 172.03±45.21pg/mL,P＜0.05）;compared with model group,DXM group and HQH group had decreased TGF-β and IL-17 contents TGF-β∶（262.69±23.53）ng/L and 352.05±26.77ng/L vs 593.84±35.02ng/L,P＜0.01;IL-17∶265.25±44.29pg/mL and 317.33±46.83pg/mL vs 602.13± 58.30pg/mL,P＜0.01）;compared with blank group,the proportion of Th17 cells and the cell number and renal mRNA expression of RORC in model group significantly increased[the proportion of Th17∶（8.62±0.77）%vs（0.05± 0.02）%,P＜0.01;Th17 cell number∶（8.62±0.77）×104/mL vs（0.05±0.02）×104/mL,P＜0.01;RORC mRNA∶（11.08± 0.89）vs（1.00±0.05）,P＜0.01];compared with model group,the proportion of Th17 cells and the cell number and the renal mRNA expression of RORC in DXM group and HQH group significantly reduced[the proportion of Th17∶（0.15±0.04）%and（4.06±0.43）%vs（8.62±0.77）%,P＜0.01;Th17 cell number∶（0.15±0.04）×104/mL and（4.06± 0.43）×104/mL vs（8.62±0.77）×104/mL,P＜0.01;RORC mRNA∶（3.67±0.39）and（5.53±0.49）vs（11.08±0.89）,P＜0.01].ConclusionHQH can decrease the excretion of proteinuria and regulate the differentiation of Th17 cells, which may be related to the down regulation of RORC mRNA expression.

MRL/lpr lupus mice;systemic lupus erythematosus;huaiqihuang;dexamethasone;renal injury;th17 cells

book=739,ebook=8

杭州市科技計劃項目（No.20140733Q25）

杭州市紅十字會醫(yī)院風濕免疫腎內科（杭州310003）

陶筱娟，Tel：13336098114；E-mail：93731496@qq.com