液滴數(shù)字PCR芯片結(jié)果自動(dòng)化讀出平臺(tái)的研究

劉松生++袁浩均++劉強(qiáng)++周洪波++毛紅菊++任偉

摘 要： 液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ddPCR）作為第三代PCR技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)核酸分子絕對(duì)定量。然而，在數(shù)字PCR結(jié)果讀出過程中，對(duì)1 000萬量級(jí)的液滴進(jìn)行統(tǒng)計(jì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且容易出錯(cuò)。針對(duì)此情況設(shè)計(jì)了液滴數(shù)字PCR芯片的自動(dòng)掃描識(shí)別平臺(tái)，系統(tǒng)包括硬件移動(dòng)平臺(tái)和軟件拍照、拼接和識(shí)別功能。軟件控制平移臺(tái)順序移動(dòng)并控制攝像頭拍照，移動(dòng)完成后把拍得的照片拼接成一張圖片，之后對(duì)圖片中的液滴進(jìn)行識(shí)別。此平臺(tái)通過二維平移臺(tái)的精確定位掃描及圖像分割、識(shí)別算法，對(duì)熒光和非熒光液滴識(shí)別率達(dá)到99.6%以上。平臺(tái)已經(jīng)應(yīng)用到了實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)數(shù)字PCR芯片上的微液滴可實(shí)現(xiàn)一鍵識(shí)別，極大的減小了識(shí)別時(shí)間和錯(cuò)誤率。

關(guān)鍵詞： ddPCR； 核酸分子定量； 自動(dòng)掃描； 液滴識(shí)別

中圖分類號(hào)： TN911?34 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1004?373X（2017）18?0001?06

Research on automatic result readout platform of droplet digital PCR chip

LIU Songsheng1， 2， YUAN Haojun2， LIU Qiang1， 2， ZHOU Hongbo2， MAO Hongju2， REN Wei1

（1. International Center of Quantum and Molecular Structures， Shanghai University， Shanghai 201900， China；

2. Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200050， China）

Abstract： As the third generation PCR technique， the droplet digital PCR （ddPCR） can realize the absolute quantification for nucleic acid molecule， but in the process of PCR result readout， the statistics of ten?million magnitude droplets wastes time and manpower， and is easy to result in errors. Therefore， an automatic scanning and recognition platform of ddPCR chip was designed. The system includes the hardware mobile platform， and has the functions of software photographing， image splicing and droplet recognition. The sequential movement of the platform and photographing of camera are controlled by the software， and then the photographed pictures are spliced into a photograph to recognize droplets in it. The recognition rate of the platform for fluorescent and non?fluorescent droplets can reach up to above 99.6% by means of the accurate positioning and scanning， image segmentation and recognition algorithms of the 2D translation platform. This platform has been applied to the laboratory， can recognize the microdroplets produced by digital PCR chip with one key， shorten the recognition time and reduce the recognition error rate greatly.

Keywords： ddPCR； nucleic acid molecule quantification； automatic scanning； droplets recognition

0 引 言

數(shù)字PCR是一種高靈敏度的核酸定量檢測(cè)方法，它將起始待測(cè)模板分散到大量的液滴反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器包含至少一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA模板，模板在微滴反應(yīng)器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，對(duì)陰性陽性（分別在明場(chǎng)和熒光下觀測(cè)）反應(yīng)器的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并算出它們相應(yīng)的比例，含有目標(biāo)DNA分子的微滴反應(yīng)器數(shù)量滿足泊松分布。根據(jù)泊松分布公式即可算出目標(biāo)DNA分子的初始拷貝數(shù)[1]。因此它是一種可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的方法。液滴式數(shù)字PCR（Droplet digital PCR， ddPCR）是利用微流控芯片產(chǎn)生液滴并以液滴作為數(shù)字PCR的微反應(yīng)器的一種高效的數(shù)字PCR平臺(tái)方法[2]。每一個(gè)ddPCR芯片可產(chǎn)生上百萬個(gè)液滴，在實(shí)際對(duì)這些微單元的統(tǒng)計(jì)過程中，液滴的大小不一、液滴間有重疊、有的液滴沒有正確聚焦以及背景光等的影響，使得統(tǒng)計(jì)液滴也成為一個(gè)挑戰(zhàn)。對(duì)于明場(chǎng)下，一般的方法是估算液滴產(chǎn)生的速度，然后再乘以液滴產(chǎn)生時(shí)間算出液滴的總數(shù)，這種方法的問題是液滴產(chǎn)生過程中速度不是恒定不變的，而且時(shí)間也不能很精確的把握；還有的方法是添加額外的檢測(cè)裝置，如在液滴產(chǎn)生通道旁添加電極檢測(cè)電容值得變化間接知道液滴數(shù)目[3]，利用昂貴的高速CCD攝像頭對(duì)液滴進(jìn)行計(jì)數(shù)[4?5]等，這些方法都極大地增加了成本。而在熒光下，目前還沒有一種快速、準(zhǔn)確、可行的方法。一般的方法是在顯微鏡下人工進(jìn)行計(jì)數(shù)液滴的亮點(diǎn)個(gè)數(shù)，這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且很容易數(shù)錯(cuò)。本文針對(duì)現(xiàn)有的ddPCR上述問題，設(shè)計(jì)了ddPCR芯片結(jié)果自動(dòng)讀出平臺(tái)。平臺(tái)能對(duì)ddPCR結(jié)果芯片進(jìn)行自動(dòng)掃描拍照，并在掃描完成后對(duì)已掃描的芯片照片進(jìn)行拼接，然后分別對(duì)明場(chǎng)和熒光照片進(jìn)行液滴識(shí)別計(jì)數(shù)，極大地節(jié)省了時(shí)間。endprint

1 ddPCR自動(dòng)分析統(tǒng)計(jì)平臺(tái)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

采用二維顯微鏡平移臺(tái)移動(dòng)系統(tǒng)、圖像采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)軟件相結(jié)合的方法，對(duì)芯片進(jìn)行掃描、拼接和識(shí)別。平臺(tái)主要包括5部分：二維平移臺(tái)、平移臺(tái)驅(qū)動(dòng)控制、平移臺(tái)手動(dòng)控制搖桿、圖像采集和計(jì)算機(jī)軟件，平臺(tái)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

通過計(jì)算機(jī)控制二維平移臺(tái)的移動(dòng)，經(jīng)過顯微鏡放大后的圖像經(jīng)圖像采集設(shè)備采集到計(jì)算機(jī)上，然后由計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行后續(xù)的圖像分析。為了不開啟軟件也能使用顯微鏡，增加了平移臺(tái)手動(dòng)控制搖桿對(duì)平移臺(tái)進(jìn)行控制。

1.1 硬件平臺(tái)

平移臺(tái)采用海德星科技（廈門）有限公司生產(chǎn)的HDS?MS?XY8060PO?I，移動(dòng)精度可達(dá)±1.5 μm。驅(qū)動(dòng)控制設(shè)備采用美國(guó)GALIL Motion Control Inc.生產(chǎn)的DMC2143控制器控制。它提供了功能強(qiáng)大的2字符命令集及終端編程調(diào)試工具軟件包，用戶可以非常方便地進(jìn)行應(yīng)用編程。圖像采集用的CCD采用的是明美公司生產(chǎn)的MD30攝像頭。手動(dòng)搖桿采用STM32單片機(jī)通過串口對(duì)平移臺(tái)進(jìn)行控制，可以在不開啟計(jì)算機(jī)的時(shí)候控制平移臺(tái)的移動(dòng)。

1.2 計(jì)算機(jī)軟件

軟件的界面如圖2所示。

軟件的主要功能有：平移臺(tái)控制功能，包括控制運(yùn)動(dòng)速度、單步步長(zhǎng)、實(shí)時(shí)顯示位置、自動(dòng)移動(dòng)到芯片不同位置等；對(duì)攝像頭控制功能，圖中視頻顯示控制和相機(jī)參數(shù)區(qū)域，包括控制曝光時(shí)間、亮度、對(duì)比度、白平衡和拍照等，顯示標(biāo)尺、顯示用于芯片對(duì)準(zhǔn)的十字架；自動(dòng)掃描功能，通過設(shè)置對(duì)整個(gè)芯片自動(dòng)掃描拍照，并在掃描后實(shí)現(xiàn)對(duì)掃描圖像的自動(dòng)拼接，使其成為一張完整芯片的液滴圖像；液滴識(shí)別功能，通過對(duì)芯片圖像自動(dòng)識(shí)別，計(jì)數(shù)并對(duì)每個(gè)液滴參數(shù)的測(cè)量。

2 圖像處理算法原理

2.1 拼接原理

由于平移臺(tái)的精確定位精度比較高，經(jīng)試驗(yàn)使用直接拼接（即兩幅圖像之間沒有重疊的部分進(jìn)行邊與邊直接連接）的效果比較理想。而對(duì)于光源的影響，經(jīng)過在自動(dòng)掃描過程中保持曝光時(shí)間不變和后面的圖像處理這兩個(gè)過程能基本消除光源的影響。使用20倍顯微鏡拼接的3行5列圖如圖3所示。

2.2 圖像識(shí)別算法原理

液滴的識(shí)別的一個(gè)難點(diǎn)在于把液滴從背景和其他雜質(zhì)中分離出來，因?yàn)樾酒谋尘邦伾鸵旱蔚膬?nèi)部反差小，而且芯片圖像中還有PDMS柱子、氣泡。并且算法還要適應(yīng)不同大小的液滴、顯微鏡下不同放大倍數(shù)下的液滴以及有可能沒有聚焦上的液滴。圖像處理過程包括濾波、圖像增強(qiáng)、圖像形態(tài)學(xué)操作等，圖4為本文中圖像處理的具體過程及油包水液滴圖像。

2.2.1 圖像的前期處理

將所拍的液滴圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像。由于顯微鏡點(diǎn)光源的影響，所以拍出來的照片邊緣的圖像會(huì)比較暗，使用直方圖均衡化可消除光源分布不均的影響[6]，圖像的效果如圖5（a）所示。

由于圖像采集CCD自身會(huì)隨開機(jī)時(shí)間增加而溫度上升、顯微鏡光源及芯片不能完全水平等影響導(dǎo)致的圖像噪聲，這里使用高斯濾波的方式減少噪聲的影響，同時(shí)也為后面的圖像增強(qiáng)做必要的準(zhǔn)備[7]，如圖5（b）所示。液滴內(nèi)部和背景反差小，所以要識(shí)別液滴靠的就是液滴的邊緣，因此圖像邊緣增強(qiáng)就是一個(gè)重要的步驟。這里的增強(qiáng)原理如下：

[邊緣增強(qiáng)=源圖像+邊緣圖像] （1）

這里的邊緣圖像使用拉普拉斯掩膜銳化，它屬于二階導(dǎo)數(shù)邊緣算子。對(duì)于數(shù)字圖像，離散函數(shù)[f（x，y）]的拉普拉斯算子可表示為：

[?2fx，y=fx+1，y+fx-1，y+fx，y+1+fx，y-1-4f（x，y）] （2）

所以可用掩膜進(jìn)行銳化。但是拉普拉斯算子對(duì)噪聲很敏感，因此前面的濾波是很必要的。同時(shí)為了消除圖像邊緣不完整液滴和光線的影響，適應(yīng)后面的自適應(yīng)二值化，在此把圖像向外鏡像擴(kuò)展20像素值，其效果如圖5（c）所示。

2.2.2 液滴分割

經(jīng)過前期的圖像處理，圖像的照明不均勻、噪聲等得到了很大的改善。之后使用自適應(yīng)閾值分割，對(duì)圖像進(jìn)行二值化分割的同時(shí)能進(jìn)一步消除照明不均、突發(fā)噪聲等的影響。本文采用局部鄰域塊的均值，由于光源分布范圍比較不均勻，經(jīng)實(shí)驗(yàn)這里取鄰域41×41的窗口即取當(dāng)前像素點(diǎn)的1 680鄰域像素的平均值作為當(dāng)前像素點(diǎn)的閾值T：

[T=i=11680Pi1 680] （3）

式中，[Pi]是當(dāng)前像素點(diǎn)的1 680鄰域像素。

之后圖像再變回邊緣擴(kuò)展前的大小。經(jīng)過這一步能很好地分離出背景與液滴（見圖6（a）），接下來使用距離變換和分水嶺算法把液滴間、液滴與背景間、液滴與雜質(zhì)間的粘連分離開來[8]。

當(dāng)然，在進(jìn)行距離變換前需要對(duì)二值圖像進(jìn)行一些形態(tài)學(xué)操作（見圖6（b）），以避免分水嶺時(shí)出現(xiàn)過渡分割。分水嶺操作時(shí)采用局部極小值分水嶺：對(duì)距離變換所得的灰度圖（見圖6（c））片采局部極大值的方式把液滴、背景、雜質(zhì)等分別分離出來，把這個(gè)圖像矩陣作為分水嶺的標(biāo)記矩陣與液滴源圖像的灰度圖像進(jìn)行分水嶺算法，之后對(duì)產(chǎn)生的分水嶺圖片邊界標(biāo)記為分水嶺脊線，用脊線取反在與二值圖像相與，即可分離出液滴（見圖6（d））。由于標(biāo)記多時(shí)分水嶺算法耗時(shí)會(huì)比較久，所以這里提出一種減少標(biāo)記的算法：即只對(duì)粘連的液滴就行分割。在進(jìn)行灰度變換之前，把二值圖像中大于正常液滴面積的快提取出來，然后對(duì)這些比較大的面積進(jìn)行距離變換和分水嶺算法分離出液滴，然后再和提取留下的圖像合并。

從圖中可以看出，一些使用形態(tài)學(xué)無法分離的粘連，使用距離變換與分水嶺結(jié)合可以很好的把它們分離出來（圖中灰色標(biāo)識(shí)）。

2.2.3 后期處理及識(shí)別

圖像形態(tài)學(xué)處理是圖像處理很常見的處理方式，二值圖像形態(tài)學(xué)預(yù)算是圖像形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，其基本運(yùn)算有腐蝕、膨脹、開運(yùn)算、閉運(yùn)算、骨架抽取等。在液滴分割過程中，為了還原液滴原來的圖像大小需要把分離出來的二值液滴圖像進(jìn)行縮放。一般的操作是進(jìn)行腐蝕和膨脹運(yùn)算，但是腐蝕和膨脹會(huì)把圖像結(jié)構(gòu)去除或把鄰近結(jié)構(gòu)合并。圖像細(xì)化是一種骨架抽取的辦法，它能在細(xì)化后保證結(jié)構(gòu)的連通性，并且保持物體的基本形狀[9]。為了保證膨脹后不粘連，采用細(xì)化的原理對(duì)圖像進(jìn)行粗化操作。因?yàn)閳D像細(xì)化會(huì)保證連通性，所以我們將圖像求反，執(zhí)行細(xì)化，將結(jié)果在求反即可實(shí)現(xiàn)粗化操作，其效果見圖7（a）。endprint

為了刪除液滴外的物體，需要把二值圖像中面積過大和過小的雜質(zhì)去除。本文使用的方法是尋找二值圖像的輪廓[10]，然后對(duì)輪廓里的面積與液滴大小的面積進(jìn)行比較，刪除過大和過小的物體見圖7（b）。

到此已經(jīng)基本完成了圖像的分割。實(shí)驗(yàn)中為了保證速度，使用對(duì)圖像中每一個(gè)輪廓實(shí)行最小外接圓操作，然后對(duì)得到輪廓的外包絡(luò)圓進(jìn)行判斷，同時(shí)滿足以下三個(gè)條件即為液滴：圓的半徑大小在液滴半徑大小范圍內(nèi)；物體的白點(diǎn)有大于6個(gè)點(diǎn)在圓上；由于形態(tài)學(xué)處理中會(huì)把一些點(diǎn)去除，所以包絡(luò)圓里白點(diǎn)的個(gè)數(shù)大于[611]圓的面積。最終得到的識(shí)別圖如圖7（c）所示，并在列表中統(tǒng)計(jì)出每個(gè)液滴的圓心、半徑和內(nèi)部像素平均灰度值。從識(shí)別效果可以看出，去除邊緣顯示不全的液滴，此算法可以識(shí)別出絕大部分的液滴。經(jīng)統(tǒng)計(jì)識(shí)別出了386個(gè)液滴，只有一個(gè)液滴由于嚴(yán)重離焦和雜質(zhì)影響而沒有被識(shí)別出來（圖中紅色圓圈），識(shí)別率達(dá)到了99.74%，這其中也包括了7個(gè)沒有正確對(duì)焦的液滴。

2.2.4 后期統(tǒng)計(jì)

由于背景、雜質(zhì)及物體焦點(diǎn)等的影響，有時(shí)液滴的二值圖像會(huì)粘連了背景，導(dǎo)致不能滿足第2.2.3節(jié)中液滴識(shí)別的三個(gè)條件；同時(shí)，液滴背景、同液滴同樣大小的氣泡等原因，有可能不是液滴的物體被識(shí)別為液滴。因此后期統(tǒng)計(jì)中本文中加入了手動(dòng)點(diǎn)擊圖片添加沒有識(shí)別到的液滴和去除錯(cuò)誤識(shí)別出的液滴。其原理是根據(jù)區(qū)域生長(zhǎng)算法的原理[11]，根據(jù)所點(diǎn)擊的位置對(duì)二值圖像進(jìn)行區(qū)域生長(zhǎng)，然后用最小外接圓包絡(luò)生長(zhǎng)出的區(qū)域。將沒有識(shí)別到的液滴直接添加到已識(shí)別出的液滴序列中；去除錯(cuò)誤識(shí)別的液滴時(shí)依次查找已有識(shí)別出的液滴序列的圓心是否與此外接圓的圓心相同，相同時(shí)去除此圓。經(jīng)過后期的檢查識(shí)別率基本上能達(dá)到100%。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，統(tǒng)計(jì)液滴半徑、像素平均灰度的最大值、最小值、均值、標(biāo)準(zhǔn)差等。為了能在熒光下區(qū)分出發(fā)熒光和不發(fā)熒光的液滴，使用K?means聚類算法根據(jù)液滴像素平均灰度值經(jīng)行分類。其原理為：對(duì)一直液滴像素平均灰度集[x1，x2，…，xn]，其中每個(gè)觀測(cè)都是一個(gè)1維實(shí)矢量，k?平均聚類要把這n個(gè)觀測(cè)劃分大2個(gè)集合中（亮和暗），使得組內(nèi)平方和最小，即找到滿足下式的聚類Si：

[mini=02x∈six-μi2] （4）

式中[μi]是[si]中所有點(diǎn)的均值。

同時(shí)為了防止有些錯(cuò)誤分類，在列表框中設(shè)置排序功能，可人工檢查分類結(jié)果。表1為圖4（b）的識(shí)別統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 識(shí)別統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表1可以看出，液滴半徑標(biāo)準(zhǔn)差只有1.009，考慮到分割和個(gè)別液滴不清晰的影響，這個(gè)差別是很小的，說明液滴大小很均勻；從實(shí)驗(yàn)圖直觀上也可以看出，聚類的亮點(diǎn)數(shù)和暗點(diǎn)數(shù)也基本符合。同時(shí)為了驗(yàn)證此方法對(duì)熒光下識(shí)別液滴同樣有效，對(duì)熒光下的液滴做了同樣的識(shí)別和統(tǒng)計(jì)，如圖8和表2所示。

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出識(shí)別出了348個(gè)液滴，其中發(fā)熒光的有10個(gè)，這與人工驗(yàn)證完全吻合。對(duì)剔除了大的雜質(zhì)后液滴半徑標(biāo)準(zhǔn)差只有1.187說明比較均一，但從最大值也可以看出有個(gè)別液滴偏離均值比較大，說明液滴形成還是不太穩(wěn)定。

3 ddPCR實(shí)驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)芯片制備

本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典的T?通道方法產(chǎn)生液滴。液滴數(shù)字PCR的制備過程與微流控芯片一樣，經(jīng)光刻、曝光、顯影將掩模板的圖形轉(zhuǎn)移到基片上，然后澆注聚二甲基硅氧烷（PDMS），最后將基片和蓋片鍵合在一起，完成芯片的制作[12]。用于制備液滴的油相和水相在流體控制模塊驅(qū)動(dòng)下從進(jìn)樣口進(jìn)入芯片微通道，并在流體表面張力和剪切力的共同作用下高速生成納升級(jí)油包水液滴[13]。液滴存儲(chǔ)區(qū)可以對(duì)液滴間的排列距離和堆積密度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，有利于在液滴PCR反應(yīng)之后將獨(dú)立的液滴分離出來，提高檢測(cè)精度。芯片制作見圖9。

3.2 芯片識(shí)別實(shí)驗(yàn)

制得ddPCR芯片之后即可進(jìn)行液滴產(chǎn)生試驗(yàn)。這里采用負(fù)壓系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)樣。之后就可以在平臺(tái)上進(jìn)行液滴識(shí)別試驗(yàn)了。分別在明場(chǎng)和熒光下進(jìn)行自動(dòng)掃描液滴，之后進(jìn)行拼接，然后識(shí)別統(tǒng)計(jì)。圖10是軟件分析的結(jié)果，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

識(shí)別過程中已經(jīng)把太小的液滴和雜質(zhì)排除掉了，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看到明場(chǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)差仍然達(dá)到了2.013，說明液滴生成過程中還有一些不穩(wěn)定的因素導(dǎo)致大小不一。經(jīng)過人工檢測(cè)，識(shí)別出的803個(gè)液滴中，只有一個(gè)是錯(cuò)誤的，識(shí)別正確率為99.88%；當(dāng)然在熒光下，由于光源的原因、加之液滴大小本來就不十分均勻，導(dǎo)致液滴半徑偏差較大比較正常。其實(shí)熒光下秩序要知道熒光液滴的個(gè)數(shù)即可，同種識(shí)別出76個(gè)熒光液滴，經(jīng)人工識(shí)別也是76個(gè)，識(shí)別正確率為100%。分別在不同放大倍數(shù)的液滴、不同大小的液滴、不同液滴圖片大小的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此只統(tǒng)計(jì)識(shí)別率，即統(tǒng)計(jì)正確分割出液滴的比例。識(shí)別統(tǒng)計(jì)如圖11所示，圖中的直線表示理想情況真實(shí)值與檢測(cè)值相等的情況。液滴在明場(chǎng)下的平均識(shí)別率達(dá)到了99.69%，這其中0.31%不能識(shí)別的液滴一般是不能正確對(duì)焦或被雜質(zhì)干擾較大的液滴。

同樣在熒光下，發(fā)熒光的液滴識(shí)出率達(dá)到了100%，因此只統(tǒng)計(jì)分類正確率，如圖12所示，圖中直線表示理想情況軟件聚類與人工分類相等的情況。由于CCD曝光時(shí)間差異、顯微鏡光線、人工甄別的主觀因素等的影響，導(dǎo)致在熒光下非熒光液滴較少時(shí)分類的結(jié)果與人工甄別結(jié)果相差較大，平均分類正確率達(dá)到90.5%，熒光個(gè)數(shù)較多時(shí)差異較大主要是液滴圖片曝光時(shí)間較大的原因。

圖12 人工分類與軟件聚類統(tǒng)計(jì)

4 結(jié) 語

本平臺(tái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)定位掃描拍照并拼接成一個(gè)大的芯片圖片。同時(shí)為了提高識(shí)別率和修正錯(cuò)誤識(shí)別，程序中有人工點(diǎn)擊圖片增加未識(shí)別的液滴或刪除所識(shí)別的液滴，明場(chǎng)識(shí)別率可達(dá)到99.69%且正確率可以達(dá)到100%，熒光下熒光液滴識(shí)別率約為100%且分類正確率可以達(dá)到87%以上。這可以極大的方便液滴數(shù)字PCR的實(shí)驗(yàn)，降低了液滴數(shù)字PCR的出錯(cuò)率，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。此平臺(tái)也可以擴(kuò)展用于其他芯片的自動(dòng)掃描拼接，用于其他如細(xì)胞、量子點(diǎn)等的掃描識(shí)別。

參考文獻(xiàn)

[1] HINDSON B J， NESS K D， MASQUELIER D A， et al. High?throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number [J]. Analytical chemistry， 2011， 83（22）： 8604?8610.

[2] MAZUTIS L， ARAGHI A F， MILLER O J， et al. Droplet?based microfluidic systems for high?throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis [J]. Analytical chemistry， 2009， 81（12）： 4813?4821.

[3] ERNST A， STREULE W， SCHMITT N， et al. A capacitive sensor for non?contact nanoliter droplet detection [J]. Sensors and actuators A： physical， 2009， 153（1）： 57?63.

[4] VLADISAVLJEVI? G T， SHAHMOHAMADI H， DAS D B， et al. Glass capillary microfluidics for production of monodispersed poly （dl?lactic acid） and polycaprolactone microparticles： experiments and numerical simulations [J]. Journal of colloid and interface science， 2014， 418（10）： 163?170.

[5] BARET J C， MILLER O J， TALY V， et al. Fluorescence?activated droplet sorting （FADS）： efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity [J]. Lab on a chip， 2009， 9（13）： 1850?1858.

[6] Wikipedia. Histogram equalization [EB/OL]. [2016?07?12]. https：//en.wikipedia.org/w/index.php？title=Histogram_equalization&oldid=724935223.

[7] LOPEZ?MOLINA C， DE BAETS B， BUSTINCE H， et al. Multiscale edge detection based on Gaussian smoothing and edge tracking [J]. Knowledge?based systems， 2013， 44： 101?111.

[8] PANG Quan， YANG Cuirong， FAN Yingle， et al. Overlapped cell image segmentation based on distance transform [C]// Proceedings of 2006 the 6th World Congress on Intelligent Control and Automation. [S.l.]： IEEE， 2006： 9858?9861.

[9] LAM L， LEE S W， SUEN C Y. Thinning methodologies： a comprehensive survey [J]. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence， 1992， 14（9）： 869?885.

[10] SUZUKI S， BE K. Topological structural analysis of digitized binary images by border following [J]. Computer vision， graphics， and image processing， 1985， 30（1）： 32?46.

[11] ADAMS R， BISCHOF L. Seeded region growing [J]. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence， 1994， 16（6）： 641?647.

[12]金慶輝，莊貴生，劉菁，等.微流控分析芯片在線尿中蛋白及LDH同工酶檢測(cè)[J].光學(xué)精密工程，2005，13（2）：151?157.

[13] SEEMANN R， BRINKMANN M， PFOHL T， et al. Droplet based microfluidics [J]. Reports on progress in physics， 2012， 75（1）： 1?11.endprint