納米金信號(hào)探針/石墨烯修飾免疫傳感器檢測(cè)微囊藻毒素

張晶晶，康天放，劉錦華，丁 玎，宋海燕，杜曉麗

(1.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京 100124；2.北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所，北京 100054)

納米金信號(hào)探針/石墨烯修飾免疫傳感器檢測(cè)微囊藻毒素

張晶晶1，2*，康天放1*，劉錦華2，丁 玎2，宋海燕1，杜曉麗1

(1.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京 100124；2.北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所，北京 100054)

納米金信號(hào)探針；石墨烯；微囊藻毒素；免疫傳感器

微囊藻毒素是一種環(huán)狀七肽肝毒素，是淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化的次級(jí)代謝產(chǎn)物。微囊藻毒素-(亮氨酸-精氨酸)(Microcystin-(Leucine-Argineine),MCLR)是目前發(fā)現(xiàn)的100多種異構(gòu)體中毒性最強(qiáng)、急性危害最大的一種[1]，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中規(guī)定MCLR限值為1 μg/L，因此建立一種快速、高靈敏度的MCLR檢測(cè)方法具有重要意義[2]。

電化學(xué)免疫傳感器具有選擇性高、響應(yīng)快、靈敏度高等特點(diǎn)，在快速分析領(lǐng)域被廣泛研究應(yīng)用[3]。納米材料的引入為免疫傳感器發(fā)展提供了新的可能性，主要用于敏感分子的固定、提高電子傳遞速率、信號(hào)的檢測(cè)和放大等[4]。納米金(AuNPs)具有比表面積大、表面活性中心多、良好的導(dǎo)電性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[5]，在免疫傳感器的構(gòu)建過(guò)程中，主要通過(guò)電化學(xué)還原[6]或化學(xué)還原[7]等方式形成不同納米微結(jié)構(gòu)的修飾層，起到提高靈敏度或固定敏感分子的作用。相較于大多數(shù)通過(guò)酶標(biāo)記物催化產(chǎn)生或放大檢測(cè)信號(hào)[8]，納米信號(hào)探針更易保持標(biāo)記載體生物活性，提高檢測(cè)穩(wěn)定性。納米金在生物標(biāo)記分析中同樣具有重要貢獻(xiàn),1971年Faulk等[9]首次將AuNPs引入到免疫分析中制成電子顯微鏡的金探針，近年來(lái)AuNPs被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、抗原、抗體和DNA的標(biāo)記物[10-12]。石墨烯(Graphene sheet，GS)具有單原子厚度，以正六邊形排列呈蜂窩狀二維平面結(jié)構(gòu)，理論比表面積達(dá)2 630 m2/g，室溫下平面電子遷移率為1.5×104cm2/(V·s)，GS還具有優(yōu)異的機(jī)械力學(xué)性能和良好生物相容性，具有固載生物活性分子和信號(hào)傳遞并放大的雙重作用，成為構(gòu)筑電化學(xué)生物傳感器的理想材料[13-15]。

本文利用1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)活化GS偶聯(lián)BSA-MCLR，將其懸濁液修飾于玻碳電極表面，在電極表面滴加一定量的混合溶液，其中含有不同濃度的MCLR和一定量AuNPs標(biāo)記的anti-MCLR(記為Ab-Au)，使溶液中MCLR與電極表面的BSA-MCLR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab-Au，通過(guò)電化學(xué)氧化將AuNPs溶于溶液中，再采用差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行陰極電位掃描，通過(guò)DPV峰電流對(duì)MCLR進(jìn)行定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀 器

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CHI660e電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)上進(jìn)行，三電極系統(tǒng)：玻碳電極(Φ=3 mm)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。2450型紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀、SPM-9600型透射電子顯微鏡(日本島津公司)；SU-8010型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；FE20型pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試 劑

石墨粉(320目，光譜純)購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O)購(gòu)于北京百靈威科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，分子量66.4 kDa)購(gòu)于Sigma有限公司。anti-MCLR(分子量15 wDa)、MCLR、BSA-MCLR、微囊藻毒素-精氨酸-精氨酸(MCRR)和微囊藻毒素-絡(luò)氨酸-精氨酸(MCYR)均購(gòu)于北京伊普瑞思科技有限公司。水合肼、H2SO4、HCl、H2O2等試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，所有試劑均為分析純及以上純度。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)，法國(guó)Millipore公司)。

1.3 石墨烯的制備

取一定量石墨放入80 ℃烘箱中干燥2 h后待用。將3.0 g K2S2O8、3.0 g P2O5、12 mL 98%濃硫酸置于三口燒瓶中，邊攪拌邊加熱至80 ℃，然后向燒瓶中加入2.0 g烘干的石墨粉末，待反應(yīng)物完全變?yōu)樗{(lán)色后停止加熱，冷卻至室溫，用二次水稀釋?zhuān)^(guò)濾，直至濾液呈中性。

采用改進(jìn)的Hummers法[16]，向預(yù)氧化的石墨中加入46 mL濃硫酸和1 g NaNO3，攪拌混合均勻后，放入0 ℃冰浴中，緩慢加入6 g KMnO4，控制反應(yīng)溫度不超過(guò)10 ℃。去掉冰浴，懸濁液溫度升至(35±3)℃，保持30 min。反應(yīng)過(guò)程中，混合物逐漸變稠，最后變成糊狀。30 min后，向燒瓶中緩緩加入92 mL水，燒瓶中劇烈冒泡，溫度升至98 ℃，稀釋的懸濁液呈褐色，在該溫度下繼續(xù)反應(yīng)15 min后，再加入28 mL熱水，進(jìn)一步稀釋。用3%的H2O2還原剩余KMnO4為無(wú)色可溶性正二價(jià)錳鹽，此時(shí)溶液呈亮黃色。趁熱過(guò)濾，并用過(guò)量的(250 mL左右) 1∶10的HCl溶液洗滌，過(guò)濾移除金屬離子。用水充分洗滌至中性后，置于60 ℃烘箱中烘干，得到黃褐色氧化石墨。

將干燥后的氧化石墨分散于二次水中，在100 W功率下超聲處理5 h，使氧化石墨片層剝落，得到棕色懸濁液。將懸濁液離心分離10 min，移去未剝離的氧化石墨，得到氧化石墨烯懸濁液。向氧化石墨烯懸濁液中加入100 μL水合肼，95 ℃水浴中攪拌反應(yīng)5 h，溶液由黃褐色變?yōu)楹谏悠酚盟浞至芟催^(guò)濾，烘箱干燥，得到黑色憎水的石墨烯。

1.4 金溶膠的制備

將8 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液迅速加入到0.01% 100 mL沸騰狀態(tài)下的HAuCl4溶液中，攪拌15 min，混合溶液的顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色。自然冷卻至室溫，即得納米金溶膠，置于4 ℃冰箱黑暗條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫傳感器的制備

將2 mg GS高度分散于水中，向其中加入100 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS，搖床中振蕩反應(yīng)2 h，然后將1 mL 60 μg/mL BSA-MCLR加入到上述混合溶液中，繼續(xù)反應(yīng)2 h。將混合溶液離心、超純水清洗，得到共價(jià)連接MCLR的石墨烯片復(fù)合物(GS-MCLR)懸濁液，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆肹17]。

將4 μL 20 μg/mL的anti-MCLR與20 μL的AuNPs膠體溶液混合，室溫下反應(yīng)30 min，AuNPs與anti-MCLR中的半胱氨酸殘基通過(guò)Au-S鍵連接，將混合溶液于14 000 r/min條件下離心1 h，移去含有未與AuNPs偶聯(lián)的抗體的上清液，所得沉淀為AuNPs標(biāo)記的anti-MCLR，分散于10 μL水中，制成Ab-Au懸濁液，標(biāo)記為Ab-Au[18]。

用粒徑為0.5 μm的Al2O3懸濁液將玻碳電極拋光成鏡面，用水沖洗后分別用乙醇和水超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈伞Ｔ诓Ｌ茧姌O表面滴加10 μL GS-MCLR溶液，室溫下晾干，得到免疫傳感器GS-MCLR/GCE，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｃ庖邆鞲衅鞯闹苽溥^(guò)程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器制備示意圖Fig.1 Fabrication process and the detection mechanisms of the immunosensor absence(a) and presence(b) of MCLR

1.6 測(cè)定方法

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金的表征

圖2A為AuNPs的紫外可見(jiàn)光吸收光譜，在519 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法計(jì)算AuNPs粒徑約為19 nm。透射電鏡圖(圖2B)顯示，AuNPs形狀呈球形，均勻分散，粒徑分布為16～20 nm。

2.2 石墨烯的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)所制備的石墨烯進(jìn)行了表征。從圖3可以看出，石墨烯呈無(wú)序、褶皺的薄紗片層結(jié)構(gòu)，部分薄片層堆疊，呈多層結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可極大地增加電極的比表面積。

2.3 電極在修飾過(guò)程中的電化學(xué)行為

采用循環(huán)伏安法考察了不同修飾電極在含1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的電化學(xué)行為，掃描電位范圍為-0.6～0.3 V，掃描速率為100 mV/s。如圖4所示，[Fe(CN)6]3-/4-在裸玻碳電極表面的循環(huán)伏安圖有1對(duì)峰形較好的氧化還原峰，氧化峰電位約為-0.18 V，還原峰電位約為-0.25 V(圖4a)；當(dāng)電極表面修飾10 μL 2 mg/mL石墨烯溶液后，氧化還原峰電流明顯增大(圖4b)，表明石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，能夠顯著提高探針?lè)肿釉陔姌O上的電子傳輸，此外，該循環(huán)伏安圖也呈現(xiàn)出較大的充電電流；當(dāng)在玻碳電極表面修飾MCLR-GS后，該修飾層對(duì)電子轉(zhuǎn)移起到阻礙作用，原因在于制備MCLR-GS修飾劑時(shí)所采用的微囊藻毒素是偶聯(lián)了牛血清白蛋白的MCLR(BSA-MCLR)，由于BSA的導(dǎo)電性差，使得MCLR-GS/GCE的峰電流明顯小于GS/GCE，但比裸玻碳電極略大(圖4c)。電極表面修飾4 μL 20 μg/mL anti-MCLR(Ab)之后，峰電流下降(圖4d)，Ab增大了探針離子通過(guò)膜的阻力；當(dāng)在電極表面修飾了含有AuNPs的修飾劑Ab-Au/MCLR-GS之后，[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的氧化還原峰電流略增大(圖4e)，說(shuō)明AuNPs顯著增大了電極表面修飾層的導(dǎo)電性，AuNPs可以通過(guò)與抗體發(fā)生化學(xué)吸附作用較好地保持抗體的生理活性。

圖4 GCE(a)、GS/GCE(b)、MCLR-GS/GCE(c)、Ab/MCLR-GS/GCE(d)和Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)在含1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of GCE(a),GS/GCE(b),MCLR-GS/GCE(c),Ab/MCLR-GS/GCE(d),Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)in 0.1 mol/L KCl solution containing of 1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

圖5 不同濃度MCLR免疫傳感器的差分脈沖伏安圖Fig.5 Differential pulse voltammograms of MCLR of different concentrationssupporting electrolyte solution:2 mol/L HCl;concentration of MCLR(a-f):0,0.100,1.00,10.0,25.0,50.0 μg/L；insert：calibration curve of determination MCLR

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1底液中鹽酸濃度的優(yōu)化考察了底液中HCl濃度(1～3 mol/L)的影響。結(jié)果顯示，峰電流信號(hào)隨著HCl濃度增加而增大，在濃度超過(guò)2 mol/L后峰電流信號(hào)下降，本文采用2 mol/L為最佳HCl濃度。

2.4.2 BSA-MCLR濃度的優(yōu)化隨著B(niǎo)SA-MCLR濃度的增加越來(lái)越多的BSA-MCLR偶聯(lián)在石墨烯表面，從而使檢測(cè)的峰電流信號(hào)增強(qiáng)，當(dāng)BSA-MCLR濃度超過(guò)60 μg/mL后，峰電流信號(hào)隨著B(niǎo)SA-MCLR濃度增加變化不大，因此選用60 μg/mL BSA-MCLR為最佳濃度。

2.4.3 anti-MCLR濃度的優(yōu)化AuNPs標(biāo)記的anti-MCLR的用量對(duì)峰電流強(qiáng)度產(chǎn)生直接影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)anti-MCLR濃度在5～20 μg/mL范圍時(shí)，峰電流信號(hào)隨anti-MCLR濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng) anti-MCLR濃度超過(guò)20 μg/mL后，峰電流信號(hào)無(wú)明顯變化，因此選擇20 μg/mL anti-MCLR為最佳條件。

2.5 免疫傳感器對(duì)MCLR的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，考察了MCLR-GS/GCE免疫傳感器對(duì)不同濃度MCLR的電流響應(yīng)。如圖5所示，差分脈沖伏安峰電流(DPV)隨MCLR濃度的增加而減小。ΔI與MCLR質(zhì)量濃度在0.1～50 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔI(μA)=0.471 5+0.155 2CMCLR(μg/L)，相關(guān)系數(shù)為0.991 6，檢出限為0.05 μg/L(S/N=3)。

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性與選擇性

免疫傳感器MCLR-GS/GCE在4 ℃下保存30 d，對(duì)濃度為10 μg/L的MCLR進(jìn)行測(cè)定，響應(yīng)電流為最初的97.3%，說(shuō)明免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性。相同實(shí)驗(yàn)條件下，以5支免疫電極檢測(cè)1.00 μg/L MCLR，響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.2%，表明制備的免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了納米金信號(hào)探針/石墨烯修飾的MCLR電流型免疫傳感器，并用于微囊藻毒素的檢測(cè)。結(jié)果表明，該傳感器操作簡(jiǎn)單，相較于酶標(biāo)記材料，AuNPs粒徑和質(zhì)量小，巰基與AuNPs形成Au-S鍵，不易脫落，與電極間的電子傳遞速率更快，靈敏度高、檢測(cè)效果良好，作為信號(hào)探針更加經(jīng)濟(jì)便捷。本研究建立的檢測(cè)MCLR的新方法快速、可靠，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和定量分析水體中MCLR具有重要意義。

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Determination of Microcystins Using a Graphene Modified Immunosensor Based on Au Nanoparticles Signal Probe

ZHANG Jing-jing1,2*,KANG Tian-fang1*,LIU Jin-hua2,DING Ding2,SONG Hai-yan1,DU Xiao-li1

(1.College of Environmental and Energy Engineering，Beijing University of Technology,Beijing 100124，China;2.Beijing Municipal Institute of Labour Protection,Beijing 100054，China)

AuNPs signal probe;graphene;microcystins;immunosensor

O657.1；TP212.2

:A

：1004-4957(2017)09-1075-06

2017-04-12；

：2017-05-31

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC0700604)資助

*

：張晶晶，博士，助理研究員，研究方向:快速檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用，Tel:15011596908,E-mail:zjjzhaxidele@163.com 康天放，博士，教授，研究方向：化學(xué)生物傳感技術(shù)及化學(xué)污染物快速檢測(cè)應(yīng)用，Tel:010-67391659,E-mail:kangtf@bjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.003