不同濃度β-淀粉樣蛋白對大鼠小膠質細胞特異性蛋白CD11b表達的影響

狄婷婷 張 美 王瑞婷

(承德醫學院，河北 承德 067000)

不同濃度β-淀粉樣蛋白對大鼠小膠質細胞特異性蛋白CD11b表達的影響

狄婷婷1張 美 王瑞婷

(承德醫學院，河北 承德 067000)

目的探討免疫細胞膜表面整合素 (CD11b)在β-淀粉樣蛋白(Aβ)所引起阿爾茨海默病(AD)中的作用、機制及與Aβ劑量的關系。方法雄性Wistar大鼠50只，隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組10只；A組大鼠雙側海馬CA1區注射5 μl生理鹽水，B～E組雙側海馬注射5 μl Aβ (分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)；HE染色觀察五組大鼠海馬CA1區細胞形態及數量變化；免疫組化(IHC)檢測海馬CA1區Aβ、CD11b表達；實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測CD11b mRNA表達。結果HE染色，光鏡下觀察D組、E組大鼠海馬CA1區神經細胞數明顯少于A組、B組、C組(P<0.01)；IHC檢測D組、E組兩組Aβ陽性表達率均高于A組、B組、C組(P<0.01)；D組、E組CD11b陽性表達率明顯高于A組、B組、C組(P<0.01)；qRT-PCR檢測大鼠海馬組織內CD11b mRNA表達D組、E組組明顯高于A組、B組、C組(P<0.01)。結論Aβ可激活小膠質細胞，募集MG到Aβ沉積部位，Aβ沉積量和CD11b表達量呈正相關。

阿爾茨海默病；淀粉樣蛋白；小膠質細胞；免疫細胞膜表面整合素

阿爾茨海默病(AD)是一種以認知功能障礙及記憶減退或缺失為主要特征的中樞神經退行性疾病〔1〕，其病理改變以大腦皮層和海馬區的神經細胞外老年斑(SP)〔2〕形成、神經細胞內出現神經纖維纏結(NFTs)〔3〕、神經突觸的丟失和神經元細胞凋亡為主要特征〔4，5〕。其中，SP是AD最具特征性的病理改變，主要由β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積而成〔6，7〕，在SP周圍有大量活化的小膠質細胞(MG)和炎性因子存在〔8，9〕。有研究認為，MG是AD腦內炎性反應中最重要的炎性細胞，介導AD病理發展的全過程。免疫細胞膜表面整合素(CD11b)為MG的特異性表面標志物，其主要在活化的MG胞質中表達，MG在AD發生過程中起“雙刃劍”的作用，即Aβ激活MG，活化的MG清除、吞噬Aβ，起保護作用〔10〕。MG的“雙刃劍”作用有無轉折點，CD11b的表達是否與Aβ劑量有關，成為AD炎癥機制的研究熱點。

1 材料與方法

1.1實驗動物、儀器及主要試劑 Wistar大鼠50只，成年雄性，年齡10～12 w，體重(250±20)g，SPF級，動物證號No.11400700022071，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。江灣Ⅰ型C腦立體定位儀；微量進樣器；Excelsior ES全自動組織脫水機；Z-BJ0010包埋聚合器；RM2125型石蠟切片機；CK40-F200相差倒置顯微鏡；Olympus顯微鏡攝像裝置；MDF-192型超低溫冰箱(-80℃)；DU80型紫外分光光度計；Mx3000P型實時熒光定量PCR儀；各種規格的微量移液器等。Aβ25～35(A4559，Lot：112M4775V)購自美國Sigma-Aldrich有限公司，HPLC檢測純度≥97%；通用型SP-9001免疫組化染色試劑盒(Lot：14188A)、辣根過氧化物酶、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒 (ZLI-9017，Lot：K136620C)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Aβ25～35抗體(Lot：980287W)購自北京博奧森生物技術有限公司；CD11b抗體(Lot：Y-07D10A)購自武漢博士德生物工程有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒(RR820A，Lot：AK4505)、RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)、DEPC水(9013A，Lot：AA1801A)、反轉錄試劑盒(RR047A，Lot：AK3701)，購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑為分析純。Aβ25～351 mg干粉溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L)，-20℃保存，臨用前置于37℃孵育5～7 d成凝膠態。

1.2動物分組及處理方法 成年雄性Wistar 大鼠隨機分為5組編號A、B、C、D、E，每組10只。大鼠麻醉后，將其固定在江灣Ⅰ型C腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜進行腦立體定位海馬CA1區，A組大鼠雙側海馬CA1區注射無菌生理鹽水5 μl，B～E組分別注射不同濃度的Aβ25～35稀釋液各5 μl(分別含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)術后注射青霉素抗感染，于注射Aβ 14 d后處死，取腦組織標本。

1.3免疫組化(IHC)檢測Aβ、CD11b表達 每組取4只大鼠腦組織制作標本后，每個標本選取海馬CA1區細胞損傷段2張石蠟切片，經二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，抗原修復，山羊血清封閉等步驟；滴加Aβ或CD11bⅠ抗(1∶80)，滴加Ⅱ抗，滴加ABC復合物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替Ⅰ抗作為陰性對照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，計算每組切片的光密度平均值，定量分析IHC檢測Aβ、CD11b陽性細胞反應程度。

1.4qRT-PCR技術檢測CD11b mRNA表達水平 每組取6只大鼠，麻醉后，迅速取新鮮腦海馬組織暫存于超低溫冰箱(-80℃)。采用Trizol法提取總RNA；紫外分光光度計檢測RNA的純度；根據RNA純度檢測結果計算應加入RNA樣品的使用量，按反轉錄試劑盒說明書于冰上將總RNA逆轉錄合成CDNA；以β-actin為內參照，在GenBank數據庫內查找CD11b的基因序列，由TaKaRa生物技術有限公司進行引物設計并合成，β-actin正義鏈5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，反義鏈5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′；CD11b正義鏈5′-ACCACTCATTGTGGGCAGCTC-3′，反義鏈5′-CACCGGCTTCATTCATCATGTC-3′。根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書，總反應體系為25 μl，反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火51℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個反應循環數，實時熒光定量PCR儀檢測AD大鼠腦組織中CD11b mRNA表達水平，記錄各組CT值，利用2-ΔΔCt的方法分析。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及SNKq檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠海馬CA1區神經組織形態結構 光鏡下觀察，A、B、C三組大鼠海馬CA1區均可見3～4層細胞，核染色深，形態完整而清晰，有神經元的突起；而D、E組大鼠海馬CA1區可見大段神經元缺失，細胞層數明顯減少，多為1～2層，剩余的細胞腫脹，其細胞核染色淺，呈空泡狀，突起消失，神經元缺失部分有大量膠質細胞浸潤，以MG為主，并可見MG吞噬神經元現象，見圖1。400倍視野下計數大鼠海馬CA1區正常完整的神經細胞數，D組(84.75±8.10)、E組(66.63±15.18)大鼠海馬CA1區神經細胞數明顯少于A組(126.25±17.37)、B組(120.63±11.34)及C組(114.75±17.79)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統計學差異(P>0.05)，D組明顯高于E組(P<0.05)。

2.2IHC觀察Aβ沉積部位及海馬CA1區Aβ的表達 Aβ陽性表達為棕黃色顆粒物，分布在神經細胞外和MG胞質中，Aβ沉積部位主要在注射區(即海馬CA1區)周圍，見圖2。IHC檢測結果顯示，D組(0.020 2±0.005 7)、E組(0.025 7±0.007 4)Aβ陽性表達率均明顯高于A組(0.002 2±0.000 4)、B組(0.004 1±0.001 0)及C組(0.006 1±0.001 6)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統計學差異(P>0.05)，D組明顯低于E組(P<0.05)。

2.3IHC觀察MG形態及CD11b表達 CD11b陽性表達為棕黃色顆粒物，包繞在神經元的周圍，主要表達在活化的MG中，表達部位與Aβ沉積部位相似。A、B、C三組大鼠海馬CA1區MG活化量少，且MG呈桿狀，分枝也較少；D、E兩組MG的胞體變大，呈橢圓，分枝增多，分布散落，見圖3。IHC檢測結果顯示，CD11b陽性表達D組(0.046 0±0.008 3)、E組(0.061 5±0.007 8)明顯高于A組(0.016 6±0.004 8)、B組(0.021 6±0.003 4)、C組(0.023 6±0.004 4)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統計學差異(P>0.05)，D、E兩組間差異顯著(P<0.05)。

2.4qRT-PCR法檢測大鼠海馬組織CD11b mRNA表達 大鼠海馬組織內CD11b mRNA表達水平D組(1.905 2±0.258 0)、E組(2.361 9±0.419 5)明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.180 3±0.060 6)及C組(1.279 5±0.182 1)(均P<0.01)，且A、B、C三組間無統計學差異(P>0.05)，D、E兩組間差異顯著(P<0.01)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區神經組織形態結構(HE，×400)

圖2 各組大鼠海馬CA1區Aβ表達(IHC，×400)

圖3 各組大鼠海馬CA1區CD11b表達(IHC，×400)

3 討 論

AD是老年人常見的一種多因異質性疾病，其病理表現多樣，涉及多種病理機制。Aβ作為AD發病的始動因子已得到公認〔11〕。體外凝聚狀態的Aβ25～35與AD患者腦內的Aβ結構相似，有研究表明Aβ能引起神經元損傷〔12〕。本研究與汪保華等〔13〕研究結果相吻合，顯示大鼠腦海馬CA1區注射Aβ25～35可誘導海馬神經元損傷，該方法可以用于AD模型制作〔14〕。

MG是中樞神經系統的免疫效應細胞，參與炎癥和神經損傷，是神經退行性疾病的始動因子和促進因素〔15〕。MG處于靜息狀態時，缺乏吞噬功能，但具有吞飲和一定的遷移能力，可清除代謝產物，起到“清道夫”的作用。CD11b為MG的特異性表面標志物，其主要在活化的MG胞質中表達，本研究提示Aβ沉積可使MG活化，吞噬Aβ，與相關研究結果一致〔16～18〕，本研究顯示Aβ劑量增長倍數為1∶2∶10∶20，而CD11b表達量為1∶1.08∶1.6∶2，即當Aβ劑量達到5 μg時活化的MG雖然明顯增多，但不足以清除過多的Aβ，致使Aβ通過依賴和不依賴于MG途徑引起D、E 兩組神經元損傷。因此可以推測，當大鼠腦內注射凝膠態的Aβ后，MG被激活，當Aβ劑量較低時，MG對Aβ的吞噬和清除能力明顯，可能還具有神經保護作用；但隨著Aβ劑量不斷增加，MG吞噬和清除Aβ的能力已經不足以清除腦內過多得Aβ，導致Aβ通過不依賴于MG途徑引起神經元損傷。黃月等〔19〕采用不同劑量移植MG對AD大鼠腦內Aβ的作用發現Aβ有趨化MG的作用，但大劑量的MG在對Aβ吞噬作用的同時加速了Aβ的形成。可見，Aβ可激活MG，募集MG到Aβ沉積部位，Aβ沉積量和CD11b的表達量呈正相關。

1賈建平，陳生弟.神經病學〔M〕.第7版.北京：人民衛生出版社，2013:217-8.

2Wong CW，Quaranta V，Glenner GG.Neuritic plaques and cerebrovascular amyloid in Alzheimer′s disease are antigenically related〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1985；82(24)：8729-32.

3Barton AJ，Harrison PJ，Najlerahim A，etal.Increased tau messenger RNA in Alzheimer′s disease hippocampus〔J〕.Am J Pathol，1990；137(3)：497-502.

4莊麗英，張志珺.神經炎癥與阿爾茨海默病〔J〕.中華行為醫學與腦科學雜志，2012；21(7)：664-5.

5陳 祥，鐘 翎.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白神經毒性作用研究進展〔J〕.中國神經精神疾病雜志，2008；34(5)：315-7.

6Fu HJ，Liu B，Frost JL，etal.Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer′s disease〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets,2010；9(2)：197-206.

7李慧源，董玉霞，姜 源，等.小膠質細胞與阿爾茨海默病炎性反應的相關研究〔J〕.中國臨床研究，2015；28(1)：129-30，133.

8朱飛奇，錢采韻.神經炎癥與阿爾茨海默病的迷茫與前景〔J〕.中國神經精神疾病雜志，2009；35(1)：50-2.

9官 杰，李 浩，劉劍剛，等.炎癥反應及抗炎藥物與阿爾茨海默病的研究進展〔J〕.中華神經醫學雜志，2012；11(12)：1282-5.

10Krabbe G，Halle A，Matyash V，etal.Functional impairment of microglia coincides with Beta-amyloid deposition in mice with Alzheimer-like pathology〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e60921.

11Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；297(5580)：353-6.

12Pan YF，Chen XR，Wu MN，etal.Arginine vasopressin prevents against amyloid beta(25-35) induced impairment of spatial learning and memory in rats〔J〕.Horm Behav，2010；57(4/5)：448-54.

13汪保華，袁 華，呂志華，等.靈芝多糖對模擬AD學習記憶障礙大鼠海馬白細胞介素-6表達的影響〔J〕.卒中與神經疾病，2007；14(4)：206-13.

14宋春未，戴雪伶，姜招峰，等.阿爾茨海默病實驗動物模型研究進展〔J〕.生物學雜志，2013；30(5)：85-8.

15Lee CY，Tse W，Smith JD.Apolipoprotein E promotes Aβ trafficking and degradation by modulating microglial cholesterol levels〔J〕.J Biol Chem，2012；287(3)：2032-44.

16Kauppinen TM，Suh SW，Higashi Y，etal.Poly(ADP-ribose) polymerase-1 modulates microglial responses to amyloid beta〔J〕.J Neuroinflammation，2011；8(1)：152.

17朱飛奇，何國厚，梁志堅.小檗堿對阿爾茨海默病大鼠模型小膠質細胞活化的影響〔J〕.中華神經醫學雜志，2009；8(9)：902-6.

18李 瑋，索愛琴，張杰文，等.β淀粉樣蛋白誘導小膠質細胞的炎性上清液對神經元凋亡的影響〔J〕.中華醫學雜志，2011；91(3)：203-6.

19黃 月，任秀花，張善峰，等.不同劑量移植小膠質細胞對阿爾茨海默病大鼠腦內β淀粉樣蛋白的作用〔J〕.中華醫學雜志，2011；91(33)：2353-7.

〔2016-09-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R363.2

A

1005-9202(2017)18-4446-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.007

河北省教育廳重點資助課題(No.ZD20131051)；河北省中醫藥抗癡呆重點研究室建設項目(No.20142803)；河北省高校重點學科資助項目(No.20130337)

1 承德護理職業學院

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事阿爾茨海默病發病機制及中藥抗癡呆作用研究。

狄婷婷(1981-)，女，碩士，副教授，主要從事阿爾茨海默病發病機制研究。