攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)

鄧守恒 胡 茵 曹風(fēng)軍 蔡曉軍 李林均 陳 萍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)

鄧守恒 胡 茵 曹風(fēng)軍 蔡曉軍 李林均 陳 萍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

目的利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒并觀察其在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)。方法擴(kuò)增目的基因VP3 cDNA，與EcoR Ⅴ酶切線性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭質(zhì)粒連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-VP3-hrGFP，PmeⅠ酶切線性化pShuttle-VP3-hrGFP并轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌，細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP3-hrGFP，并經(jīng)PCR、EcoR Ⅴ、PacⅠ酶切電泳及測序鑒定，線性化的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增，CsCI密度梯度離心法行病毒濃縮和純化并將其感染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，觀察其感染效率及VP3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建鑒定成功，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出402 bp的片段；pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)VP3-hrGFP編碼區(qū)成功克隆入腺病毒pAd中，且其序列與GenBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包裝出攜帶VP3基因的重組腺病毒，滴度為1.738×1012opu/ml，重組腺病毒可在SW480細(xì)胞內(nèi)得到有效表達(dá)。結(jié)論用細(xì)菌內(nèi)同源重組法可快速、高效地制備攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒，并可在人結(jié)腸癌細(xì)胞中高效表達(dá)。

同源重組；凋亡素；腺病毒；人結(jié)腸癌細(xì)胞

凋亡素VP3基因來源于雞貧血病毒，其編碼的VP3蛋白僅可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞和二倍體細(xì)胞不起作用，被認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上具有選擇性殺傷腫瘤的凋亡蛋白〔1，2〕。研究顯示VP3蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用與其在細(xì)胞中的定位密切相關(guān)，VP3蛋白定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化反應(yīng)與DNA結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而在正常細(xì)胞中，VP3蛋白則定位于細(xì)胞質(zhì)中不能發(fā)生磷酸化反應(yīng)，基于生物膜的屏障作用，通過增加VP3蛋白的跨膜能力以增強(qiáng)其選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞能力成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)〔3，4〕。本組前期利用Pep-1穿膜肽構(gòu)建的Pep-1-VP3融合蛋白理論上能夠增強(qiáng)VP3蛋白的跨膜能力，然而，由于工程菌表達(dá)量低，表達(dá)產(chǎn)物有包涵體以及分離和純化蛋白技術(shù)受限等使得制備的融合蛋白在后續(xù)研究中效果并不令人滿意〔5，6〕。為解決以上難題，筆者又選用改良腺病毒作為載體，采用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶VP3基因的重組腺病毒并作用于體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，觀察其透膜及表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 SW480及AD293細(xì)胞、PET15b-VP3重組質(zhì)粒、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP、感受態(tài)大腸桿菌DH5α和超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183、pfuDNA聚合酶，EcoR Ⅴ、PmeⅠ、PacⅠ、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)均由湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供；超速冷凍離心機(jī)(HCP80MX，日本)、PCR儀(Biometra，德國)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(Touching 995gel document system，上海)。

1.3pShuttle-VP3-GFP重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 采用定向同源重組法連接經(jīng)EcoR Ⅴ酶切線性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭質(zhì)粒和含VP3基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后行PCR鑒定，鑒定體系為：50×dNTP(10 mmol/L)1 μl，10倍緩沖液5 μl，10×上游引物P1 5 μl，10×下游引物P25 μl，含重組質(zhì)粒的菌落1 μl、pfuDNA聚合酶1 μl加去離子水至50 μl，鑒定正確后大量培養(yǎng)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒行EcoR Ⅴ酶切電泳鑒定。

1.4pAd-VP3-GFP重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PmeI酶切上述鑒定正確的pShuttle-VP3-GFP重組穿梭質(zhì)粒24 h后，3 mol/L NaAc和無水乙醇沉淀DNA，漂洗離心棄上清，加入3 μl CIAP 37℃恒溫水浴1 h后在50℃烤箱里去磷酸化2 h，經(jīng)酚、氯仿抽提后轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的BJ5183，通過TB固體培養(yǎng)基鋪板對含有重組質(zhì)粒的BJ5183進(jìn)行初篩(因含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌可在含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長形成克隆菌落)，挑取單克隆菌落，小量培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，PacI酶切電泳，若出現(xiàn)大于23 kb和45 kb或30 kb的特征性條帶，即為陽性質(zhì)粒，大量擴(kuò)增并抽提陽性質(zhì)粒，送上海生工公司測序。

1.5pAd-VP3-GFP重組腺病毒制備 脂質(zhì)體包裹PacⅠ酶切線性化的pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，取第一代病毒上清再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，依上述方法再取第二代上清重復(fù)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，收集并裂解細(xì)胞獲得上清液，氯化銫密度梯度離心純化病毒，紫外光度計(jì)檢測病毒OD260和OD280值，病毒滴度=OD260×病毒稀釋倍數(shù)×1.1×1012。

1.6pAd-VP3-GFP重組腺病毒在SW480細(xì)胞中的表達(dá) 體外復(fù)蘇并培養(yǎng)SW480細(xì)胞，長至75%～80%融合時(shí)，分別取MOI=0、100、200、300的病毒進(jìn)行感染，倒置熒光顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中GFP的表達(dá)情況，收集感染60 h的SW480細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行VP3蛋白的Western印跡檢測。

2 結(jié) 果

2.1VP3基因擴(kuò)增及pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以PET15b-VP3為模板行PCR擴(kuò)增后電泳可見特征性402 bp VP3基因片段，回收擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化的穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP混合，將混合后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，取轉(zhuǎn)化菌液在TB瓊脂糖上鋪板，次日取單克隆菌落PCR擴(kuò)增后電泳也可見特征性的402 bp條帶。大量培養(yǎng)陽性克隆菌落，抽提質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅴ酶切后電泳后可見8.9 kb和402 bp兩條帶，說明VP3基因已成功插入到穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP中，pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

2.2pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將酶切線性化的pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183并鋪板，次日挑取轉(zhuǎn)化菌落提取DNA，PacI酶切電泳可見大于23 kb和45 kb的片段，見圖2，說明pAdeasy-1與pShuttle-VP3-hrGFP在復(fù)制起始位點(diǎn)與右臂之間發(fā)生了同源重組。pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒測序結(jié)果顯示其VP3基因序列與GenBank的VP3 cDNA序列完全一致，見圖3，說明VP3基因已成功插入到骨架質(zhì)粒pAdeasy-1中，pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA Marker；1：pShuttle-VP3-hrGFP經(jīng)EcoR Ⅴ酶切后 (8.9 kb、402 bp)圖1 pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

M：DNA Marker；1：pAd-VP3-hrGFP經(jīng)PacI酶切后(>23 kb、4.5 kb)圖2 pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

圖3 pAd-VP3-GFP重組腺病毒質(zhì)粒部分測序結(jié)果

2.3pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒包裝及滴度測定 酶切線性化pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒，脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，培養(yǎng)1 w后可見綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，見圖4A，此后細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)，見圖4B。待病變效應(yīng)達(dá)到80%至90%時(shí)，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融后離心獲得病毒上清液，純化病毒，檢測OD260和OD280值分別為0.158和0.119，OD260/OD280=0.158/0.119=1.33>1.3，病毒滴度= OD260×病毒稀釋倍數(shù)×1.1×1012=1.738×1012opu/ml。

圖4 重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包裝(×100)

2.4pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒在SW480細(xì)胞中的表達(dá) 將制備的重組腺病毒感染SW480細(xì)胞，60 h后可見到明顯的GFP陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)量隨著MOI值的升高而增多，免疫印跡結(jié)果顯示感染60 h后SW480細(xì)胞中可以檢測到VP3蛋白表達(dá)，表達(dá)量隨病毒MOI值的提高而升高，說明制備的重組腺病毒可有效感染SW480細(xì)胞并能在細(xì)胞中得到較好的表達(dá)，見圖5。

1～4：MOI=300、200、100、0重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP在SW480細(xì)胞內(nèi)作用60 h后VP3蛋白的表達(dá)圖5 Western印跡法檢測VP3蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

基因治療是惡性腫瘤治療的新的有效手段，安全有效的基因載體是成功進(jìn)行基因治療的關(guān)鍵。腺病毒既可以感染分裂期細(xì)胞，又可以感染增殖期細(xì)胞，且可在感染的細(xì)胞內(nèi)獲得高效表達(dá)，是當(dāng)前基因治療最常用的運(yùn)載工具〔7，8〕。本文所用的腺病毒是經(jīng)過改良敲除了病毒E1和E3區(qū)基因的復(fù)制缺陷性雙鏈DNA腺病毒。這種腺病毒失去了復(fù)制和致病能力，可安全用作外源基因?qū)塍w內(nèi)的載體，將其轉(zhuǎn)化到含有E1或E3區(qū)基因的細(xì)胞如人胚腎AD293細(xì)胞內(nèi)即可進(jìn)行病毒的大量包裝和復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于〔9～11〕：基因結(jié)構(gòu)簡單，背景清楚，制備較容易；基因組不與宿主細(xì)胞整合，安全性好；繁殖滴度高，對靜止細(xì)胞也能感染；宿主廣泛，感染效率高。

本文首先通過設(shè)計(jì)5'端帶有pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭質(zhì)

粒EcoR Ⅴ酶切線性化末端18個(gè)堿基的上下游引物對VP3目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，使得擴(kuò)增的VP3目的基因產(chǎn)物與線性化穿梭質(zhì)粒具有相同的黏性末端，二者混合在同源重組酶作用下易發(fā)生同源重組形成攜帶VP3基因的pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒，然后將線性化的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的超感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，制備重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP3-hrGFP，通過PCR、抗性基因初篩，酶切電泳及測序等方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定以證實(shí)構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒準(zhǔn)確無誤。本文中兩次同源重組過程均在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行，與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行比較具有明顯優(yōu)勢，一是細(xì)菌繁殖和同源重組能力強(qiáng)，且對周圍環(huán)境要求不嚴(yán)，重組效率較高。二是細(xì)菌內(nèi)PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒抽提、酶切等技術(shù)均較在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)操作更加簡單，整個(gè)操作過程也更加簡便順利〔12〕。

本文制備的重組腺病毒可達(dá)到很高滴度，且感染率高，性質(zhì)較穩(wěn)定，可有效進(jìn)入SW480細(xì)胞內(nèi)并能穩(wěn)定表達(dá)，VP3蛋白表達(dá)量與病毒感染量呈一定的量效和時(shí)效關(guān)系。

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〔2016-06-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R285

A

1005-9202(2017)18-4460-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.012

湖北省自然科學(xué)基金(No.2008CDZ041)；湖北省衛(wèi)生廳基金(No.QJX2008-42)

陳 萍(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤藥理研究。

鄧守恒(1973-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤藥理研究。