胰島素樣生長因子-1抑制慶大霉素引起的小鼠耳蝸毛細胞凋亡

馬志云 宮 亮 王雪峰

(遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻喉科，遼寧 錦州 121001)

胰島素樣生長因子-1抑制慶大霉素引起的小鼠耳蝸毛細胞凋亡

馬志云 宮 亮 王雪峰

(遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻喉科，遼寧 錦州 121001)

目的探討胰島素樣生長因子(IGF)-1是否通過Notch信號通路抑制慶大霉素(GM)引起的離體小鼠耳蝸毛細胞凋亡。方法體外培養新生小鼠耳蝸基底膜，在分別含有正常對照培養液(A組)、0.5 mmol/L GM(B組)、0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C組)的成分中培養24 h后收集細胞及固定。應用TUNEL法觀察各組耳蝸毛細胞的凋亡情況。應用Western印跡、實時定量聚合酶鏈反應(PCR)觀察各組小鼠基底膜Notch2/hes1信號通路的表達量。結果A組觀察到少量凋亡毛細胞，B組耳蝸毛細胞凋亡數量及Notch2/hes1的表達量較A組明顯上升(P<0.01)，C組細胞凋亡數量及Notch2/hes1的表達量較B組明顯下降(P<0.01)。結論IGF-1通過抑制Notch2/hes1信號通路，減少GM誘導的離體耳蝸毛細胞凋亡。

胰島素樣生長因子-1；Notch2/hes1信號通路；耳蝸毛細胞；凋亡

胰島素樣生長因子(IGF)-1廣泛存在于動物體內，促進細胞增殖并抑制凋亡。IGF-1在噪聲暴露、缺血再灌注、氨基糖苷類藥物損傷中可保護耳蝸，減少毛細胞凋亡，但其在耳蝸生長發育、抑制毛細胞凋亡中具體保護作用機制尚不明確〔1～3〕。Notch信號通路是在細胞增殖和凋亡中反復參與調節的少數信號轉導系統之一，控制細胞在內在或外在環境變化時的發展方向，影響細胞分化、增殖、凋亡程序〔4〕。本實驗觀察Notch2/hes1信號通路表達的變化以明確IGF-1是否通過Notch2/hes1蛋白信號通路調控GM誘導的離體小鼠耳蝸毛細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取12只新生4 d健康昆明小鼠(24耳)，采用隨機數字表法分為3組，離體培養小鼠耳蝸基底膜：8個耳蝸作為正常對照組(A組)；8個耳蝸置于0.5 mmol/L GM培養液中(B組)；8個耳蝸置于0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C組)。48 h后收集細胞。

1.2主要儀器及試劑 胎牛血清及DMEM培養基(美國Gibco公司)；TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)；實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(美國Qiagen公司)；TUNEL檢測試劑盒(美國R&D公司)；抗Notch2/hes1抗體及二抗(英國Abcam公司)。激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510M，德國)。

1.3TUNEL染色檢測凋亡毛細胞 采用新生昆明小鼠耳蝸器官離體培養技術〔5〕，制作各組耳蝸組織鋪片；加用熒光素(FITC)標記的TUNEL反應混合液；陰性對照為省去TUNEL的反應液。對各組毛細胞進行染色，經4%多聚甲醛固定，紅色熒光標記細胞為TUNEL染色陽性結果。

1.4激光共聚焦顯微鏡觀察 以相應波長(FITC 為514 nm，cy3為554 nm，cy5為610 nm)激光激發后，目鏡上配計數格，在激光共聚焦顯微鏡下分別于各組耳蝸鋪片隨機選取相互不重復的4個視野，在400倍物鏡下計數每視野紅色熒光標記的凋亡細胞數，并進行定量分析。

1.5Notch2/hes1蛋白表達檢測 耳蝸總蛋白中Notch2/hes1蛋白的表達采用Western印跡技術檢測：將總蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳后(每一樣本均含總蛋白60 μg)，轉印至硝酸纖維素膜上，應用增強化學發光法檢測Notch2/hes1蛋白的表達。選用兔抗Notch2/hes1及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體。膠片分析時運用HPlsA 1000圖文分析系統，Notch2/hes1蛋白的相對表達水平用灰度值表示。

1.6Notch2/hes1基因表達檢測 Notch2 mRNA/hes1 mRNA的表達參照Trizol Reagent說明書操作，采用Access RT-PCR系統將由耳蝸組織提取的總RNA 1 μg一步法擴增成DNA目的片段。反應循環參數為：48℃ 45 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個循環；72℃ 10 min；4℃保存。Notch2引物序列：上游序列為5′CCTGAACGGGCAGTACATTT3′，下游序列為5′GCGTAGCCCTTCAGACACTC3′，目的片段為165 bp。hes1引物序列：上游序列5′CCCACCTCTCTCTTCTGACG3′，下游序列為5′AGGCGCAATCCAATATGAAC3′，目的片段為185 bp。內參照β-actin，上游序列為5′ACGTTGACATCCGTAAAGAC3′，下游序列為5′GAAGGTGGACAGTGAGGC3′，目的片段為520 bp。用Notch2/hes1與β-actin灰度比值表示Notch2 mRNA/hes1 mRNA相對表達水平。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行F檢驗，兩組間差異比較運用SNK法。

2 結 果

2.1各組凋亡毛細胞 A組觀察到少量凋亡細胞，凋亡率(1.36±0.98)%；B組凋亡率(16.15±1.07)%較A組明顯增多(P<0.05)；C組凋亡率(12.11±1.31)%較B組明顯減少，與A組差異亦有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組耳蝸鋪片凋亡細胞(箭頭指示，×400)

2.2各組耳蝸毛細胞Notch2/hes1蛋白及mRNA相對表達量 加藥處理48 h后，Notch2/hes1蛋白及mRNA表達B組較A組明顯增高(P<0.01)；C組較B組明顯減少(P<0.05)。Western印跡結果見圖2，RT-PCR結果見圖3和表1。

圖2 各組Notch 2、hes1及β-actin 蛋白條帶圖

圖3 各組Notch2和hes1 mRNA表達

組別Notch2蛋白Notch2mRNAhes1蛋白hes1mRNAA組0.254±0.1430.231±0.1200.217±0.1760.216±0.190B組0.557±0.2601)0.576±0.1101)0.312±0.1631)0.365±0.2901)C組0.304±0.1062)0.375±0.0802)0.232±0.1592)0.245±0.1102)

與A組相比：1)P<0.05；與B組相比：2)P<0.05

3 討 論

IGF-1 是一種活性單鏈多肽物質，以往研究表明，敲除IGF-1基因的鼠耳蝸生長分化和成熟受到嚴重影響，且出現明顯聽力下降〔6〕。Yamamoto等〔3〕在氨基糖苷類耳毒性離體基底膜中應用IGF-1，同時觀察到了支持細胞周期的激活和毛細胞凋亡的抑制。陳冬等〔7〕發現IGF-1對GM引起的離體耳蝸毛細胞凋亡的保護作用有明顯的濃度依賴特點，其中10 ng/ml IGF-1為最佳保護濃度。研究表明IGF-1對耳蝸毛細胞的保護作用可能通過Wnt通路調節〔8〕。最新研究證明IGF-1可以抑制氨基糖苷類藥物損傷誘導的毛細胞凋亡，并觀察到分裂原活化抑制劑(MEK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)通路的激活，但具體保護作用機制目前尚不清楚〔9〕。Yamahara等〔10〕在人工耳蝸外植體培養系研究中發現，可用IGF-1來維持毛細胞數量，認為IGF-1可抑制毛細胞凋亡并可促進支持細胞的增殖。Notch信號通路是在細胞增殖和凋亡中少數反復參與調節的信號轉導系統，在多細胞機體細胞凋亡、增殖和分化方面有重要作用。目前Notch信號通路在腫瘤細胞的增殖與凋亡等領域研究較深入，但在耳蝸毛細胞的凋亡方面研究較少〔11〕。

Notch信號轉導途徑包括Notch受體、Notch配體〔Delta/Serrate/Lag2(DSL)蛋白，哺乳動物為Jagged蛋白〕、細胞內效應分子(CSL蛋白)、DNA結合蛋白(RBP-J)、其他的效應物及Notch的調節分子等。下游靶基因如Hes1、Hes5等轉錄因子家族與CSL結合后大量表達，進而影響細胞的分化、增殖與凋亡〔12〕。作為Notch受體的靶基因之一，Hes1表達轉錄的hes1蛋白是一種轉錄抑制因子，基本結構為堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)。在Hes1基因突變小鼠耳蝸可觀察到明顯增多的耳蝸內毛細胞，而缺失Hes1基因則會發現橢圓囊或球囊有額外的毛細胞產生〔13〕。研究發現，激活不同的Notch受體會產生不同的作用，其中Notch2通過hes1起作用〔14〕。本實驗說明GM可以誘導離體培養的毛細胞凋亡，與前人研究結果一致〔7，8，10〕；Notch2/hes1信號通路在GM誘導的離體耳蝸毛細胞凋亡過程中被激活。研究表明，腫瘤壞死因子(TNF)信號可通過激活Notch2，并上調其表達量，然后通過調節控制凋亡的關鍵調節劑而誘發細胞凋亡〔11〕。Batts等〔15〕運用卡那霉素制造豚鼠耳毒性模型，在毛細胞損傷24 h后運用Western印跡和免疫組化技術分析顯示，參與激活Notch通路的蛋白增加，存活的支持細胞中所有Notch信號組分(包括Notch2和hes1)都是上調的。這些結果提示哺乳動物的聽覺細胞在受到損傷后仍具有短暫調節Notch信號和hes基因活性的能力。這與本研究結果一致。本實驗結果說明IGF-1可以減少GM誘導的離體耳蝸毛細胞凋亡。GM誘導的離體耳蝸毛細胞凋亡模型中加入IGF-1后Notch2/hes1信號通路被抑制。在內耳發育早期，Wnt信號通路和Notch信號通路均參與聽板發育的調節，且可相互調節〔16〕。Wnt信號可以調節Notch信號通路中Jag1配體基因、Notch1受體基因和下游靶基因Hes1等基因的表達，反過來Notch信號也能促進Wnt信號通路中相關基因的表達。因此，IGF-1很可能通過Notch2/hes1信號通路保護GM誘導的耳蝸毛細胞凋亡，但具體作用位置、是否與Wnt通路存在聯通機制尚不清楚。黃飛等〔17〕在GM耳毒性離體基底膜培養時加入γ-分泌酶抑制劑(DAPT)，發現Notch2/hes1信號通路表達降低，認為DAPT可能通過抑制此通路而減輕毛細胞損傷。因此，在進一步研究中，可用Notch2/hes1基因缺陷小鼠進一步驗證本實驗結果，并找出IGF-1在此通路的具體作用部位。

綜上，IGF-1對耳蝸的保護作用可能是通過抑制Notch2/hes1信號通路而減輕GM誘導的毛細胞凋亡。人類毛細胞損傷后不可再生，Yamahara等〔10〕在人工耳蝸外植體培養系研究中應用IGF-1，發現IGF-1是維持現有毛細胞數量并促進支持細胞再生的新方法。最新臨床試驗證明，通過圓窗膜應用IGF-1可改善突發性耳聾患者的聽力〔18〕。Batts等〔15〕實驗結果表明，哺乳動物的聽覺細胞在受到損傷后仍具有短暫調節Notch信號和hes基因活性的能力。本實驗為IGF-1聯合人工耳蝸植入治療重度感音神經性耳聾提供了新的理論依據。

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〔2016-09-11修回〕

(編輯 苑云杰)

R762

A

1005-9202(2017)18-4469-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.016

2014年遼寧省教育廳科學研究項目(No.L2014323)；遼寧醫學院校長基金-奧鴻博澤研究生科技創新基金(No.AH2014015)

宮 亮(1980-)，男，博士在讀，副主任醫師，副教授，主要從事耳鼻喉疾病研究。 王雪峰(1965-)，男，博士，主任醫師，主要從事耳鼻喉疾病研究。

馬志云(1989-)，女，碩士，住院醫師，主要從事耳鼻喉疾病研究。