益肺解毒方聯合順鉑對肺腺癌A549細胞增殖的影響

趙 丹 牟海軍 畢紅霞 石寒冰 孫璽媛 趙學梅 蔣麗艷 宋 波 王紹清

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院呼吸二科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

益肺解毒方聯合順鉑對肺腺癌A549細胞增殖的影響

趙 丹1牟海軍 畢紅霞 石寒冰 孫璽媛2趙學梅1蔣麗艷1宋 波1王紹清1

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院呼吸二科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

目的探討益肺解毒方聯合順鉑對人肺腺癌A549細胞增殖的影響。方法(1)應用血清藥理學方法制備益肺解毒方藥物血清。60只SD大鼠，分為低、中、高劑量組及空白血清組，每組15只。給予低、中、高劑量益肺解毒方煎劑及等體積生理鹽水灌胃3 d，然后腹主動脈取血，制備益肺解毒方藥物血清。(2)應用噻唑藍(MTT)法檢測益肺解毒方含藥血清、順鉑及將兩者協同后對人肺腺癌A549細胞增殖的抑制作用。益肺解毒方藥物血清組分為3個劑量組(低、中、高劑量組)、空白血清組、 順鉑組；聯合組(低、中、高劑量益肺解毒方與空白血清聯合順鉑)。將順鉑設為5個濃度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另設空白對照組、空白調零組。每組設6個復孔，實驗重復3次。計算各組對人肺腺癌A549細胞增殖抑制率。結果低、中、高劑量益肺解毒方藥物血清對人肺腺癌A549細胞增殖均具有抑制作用(P<0.05)，且劑量與抑制率呈一定量效關系。順鉑對人肺腺癌A549細胞增殖亦具有抑制作用，且隨著濃度的增高，抑制率逐漸增高，作用呈現濃度依賴效應。中、高劑量益肺解毒方藥物血清與順鉑協同，協同指數>1.15，數據結果提示益肺解毒方可以協同順鉑增加其療效。而應用低劑量益肺解毒方則與順鉑協同效應為單純相加。結論益肺解毒方聯合順鉑對肺腺癌A549細胞具有協同增效作用。

益肺解毒方；順鉑；肺腺癌A549細胞；細胞增殖；細胞凋亡

肺癌發病率、死亡率均位于惡性腫瘤第一〔1〕，臨床主張采用綜合治療。本課題組自主研制益肺解毒方，其主要作用為補氣養陰以助正氣；解毒消癥以祛邪氣。前期臨床研究發現此方可改善老年肺癌患者呼吸道臨床癥狀和體力狀況，提高生活質量；與化療結合，臨床療效明顯增強，且不良反應發生率較低，患者的依從性、耐受性較高〔2〕。但其作用機制尚不明確。本課題觀察益肺解毒方藥物血清聯合順鉑對人肺腺癌A549細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠(北京維通利華有限公司)；人肺腺癌A549細胞(齊醫學院岳麗玲研究員贈)。益肺解毒方主要組成包括生白術、生黃芪、北沙參、石見穿、天冬、茯苓、石上柏、山藥、金雀根、重樓等藥物；胎牛血清(Hyclone)；順鉑 (購于江蘇豪森藥業)；F12培養基(Sigma)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；噻唑藍(MTT，Amresco)。

1.2方法

1.2.1益肺解毒方藥物血清制備 將60只SD大鼠編號，隨機分為高、中、低劑量組及空白血清組，每組15只。給藥劑量分別為96、48、24 g·kg-1·d-1及等體積生理鹽水。每日進行兩次灌胃、持續灌胃達3 d。于末次給藥后2 h行腹主動脈取血，血液于室溫下靜置45 min，離心15 min，然后將同組血清收集、混勻，置于恒溫(56℃)水箱中，滅活30 min，使用微孔濾膜(0.22 μm)行過濾除菌，然后進行分裝，保存在-20℃冰箱內。

1.2.2MTT法檢測 應用MTT法檢測單獨應用益肺解毒方藥物血清和順鉑人肺腺癌A549細胞增殖能力的影響及兩者聯合應用后對A549細胞增殖能力的影響。實驗將益肺解毒方組分為3個劑量組(低、中、高劑量組)、空白血清組、 順鉑組、聯合組(低、中、高劑量益肺解毒方與空白血清聯合順鉑)。將順鉑設為5個濃度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另設空白對照組、空白調零組。每組設6個復孔，實驗重復3次。計算各組對人肺腺癌A549細胞增殖抑制率。抑制率=1-(實驗組OD值-空白調零組OD值)/(空白對照組OD值-空白調零組OD值)×100%〔3〕。用對數法計算順鉑的半抑制濃度(IC50)。按照金氏公式〔4〕判斷兩藥協同效應：拮抗、相加或增強。求q值，q=E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)〔5〕，E(A+B) 表示兩藥合用的抑制率；EA、EB為兩藥分別使用時的抑制率。若q值<0.85為兩藥聯合具有拮抗效應；>1.15為兩藥聯合具有增強效應；1.15～0.85為兩藥聯合具有相加效應。

1.3統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

空白對照組與空白血清組人肺腺癌A549細胞OD值比較無統計學差異(P>0.05)，說明空白血清作用于人肺腺癌A549細胞后，對其增殖無影響。低、中、高劑量組OD值與空白對照組比較有統計學意義(P<0.05)。順鉑對肺腺癌A549細胞增殖具有抑制作用，并在一定范圍呈現濃度依賴效應。低、中、高劑量組及空白血清組與不同濃度順鉑聯合應用后，對人肺腺癌A549細胞的抑制率均較單純順鉑組提高。但空白血清協同順鉑組與順鉑組比較無統計學意義(P>0.05)。低、中、高劑量益肺解毒方藥物血清聯合順鉑與單純順鉑組比較有統計學差異(P<0.05)。低劑量益肺解毒方藥物血清聯合順鉑組q值為0.91～1.13，提示協同效應為單純相加。而中、高劑量益肺解毒方藥物血清聯合順鉑組q值多>1.15，提示協同效應為增強，其中高劑量益肺解毒方藥物血清與順鉑協同增效作用最強。見表1，圖1。

表1 益肺解毒方對人肺腺癌A549細胞增殖作用的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05

圖1 益肺解毒方聯合順鉑對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

3 討 論

肺癌的病因及病機是正虛為本，邪實為標。正虛者又以氣虛及陰虛兩證型多見，約占80%〔6〕，實則氣滯、血瘀、痰阻、熱毒之病理變化。中醫認為化療藥物是一種熱毒，化學治療是一種以毒攻毒的治療方法，耗傷正氣，損耗陰液，致機體氣陰兩虛，因此，確立了益氣養陰、清熱解毒的治療方法。該方針對肺癌的病因、病機和癥候特點制定，是長期臨床實踐的成果。先期聯合化療治療老年晚期非小細胞肺癌，研究結果發現益肺解毒方加化療組緩解率為31.82%，而單純化療組僅為15%，其病灶穩定率為77.27%，而化療組為40%。化療組血液毒性不良反應的發生率為28%，化療加中藥組為19%，遠處轉移率亦較化療組降低，1、2、3年生存率明顯提高，生存質量評分亦明顯大于單純化療組〔2，7〕，表明益肺解毒方具有穩定病灶，緩解癥狀，抑制腫瘤遠處轉移，改善生存質量，延長生存期，提高生存率，而且其毒性低、不良反應較少，與化療藥物協同具有顯著的增效減毒作用。益肺解毒方為一復方制劑，成分極其復雜，藥物經煎煮及口服吸收等一系列變化，有的藥物是藥物本身物質發揮作用，有的是通過代謝產物發揮作用，機制不同。

因此通過直接提取中藥后得到的粗提取物進行體外實驗并且進一步做藥物評價并不科學準確。血清藥理學的實驗方法為先將藥物應用于動物，待藥物進入動物體內到達血液系統，取其血清，將動物血清作為藥物源來進行藥理學觀察〔8～10〕。本研究結果表明，益肺解毒方含藥血清可以抑制肺腺癌A549細胞的增殖，并且當其與順鉑聯合后，抑制率較單純順鉑組明顯提高，表明兩者合用具有顯著協同增效作用。

1林 森.大數據解讀癌癥〔J〕.百科知識，2016；(8)：4-7.

2孫璽媛，梁雋婷，姜 梅，等.益肺解毒方對老年晚期肺癌患者生存質量的影響〔J〕.遼寧中醫雜志，2012；39(11)：2176-8.

3朱達堅.姜黃素與伊立替康對結直腸癌lovo細胞的協同作用及其機制研究〔D〕.廣州：南方醫科大學，2014.

4金正均.論 Lineweaver-burk直線化公式的應用〔J〕.中國藥理學報，1980；1(1)：3-5.

5陳紅專，孫 琛，俞靄瑤，等.賴氨酸鍺和環磷酰胺合用對小鼠S-180肉瘤抑制作用〔J〕.中國藥理學通報，1991；7(1)：32-5.

6劉嘉湘.辯證治療原發性肺癌310例療效分析〔J〕.上海中醫藥雜志，1985；(10)：3-5.

7孫璽媛，梁雋婷，李 松，等.中醫辨證聯合第三代細胞毒單藥治療老年晚期非小細胞肺癌22例〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(18)：4526-7.

8陳 寧，宋冬雪，凌 娜，等.中藥血清藥理學方法的研究進展〔J〕.北京聯合大學學報(自然科學版)，2014；28(1)：40-3.

9陳 錢，黃成然，陳 凱，等.血清藥理學方法應用的研究進展〔J〕.吉林醫藥學院學報，2015；36(1)：65-8.

10林 慧，梅全喜.單味中藥及其復方制劑抗腫瘤血清藥理學研究進展〔J〕.中國藥房，2016；27(4)：550-2.

〔2016-10-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R734.2

A

1005-9202(2017)18-4484-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.023

黑龍江省教育廳科學技術項目(No.12541934)

1 齊齊哈爾醫學院 2 齊齊哈爾市第一醫院中醫腫瘤科

牟海軍(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

趙 丹(1979-)，女，碩士，講師，主要從事病原與腫瘤研究。