α1整合素活化在β淀粉樣蛋白誘導神經細胞死亡中的作用

王華民 齊平建 于 東 董虹廷 史 進 及時雨 劉 睿 李欽濤

(鄭州大學附屬南陽醫院 南陽市中心醫院神經外科，河南 南陽 473000)

α1整合素活化在β淀粉樣蛋白誘導神經細胞死亡中的作用

王華民 齊平建 于 東 董虹廷 史 進 及時雨 劉 睿 李欽濤

(鄭州大學附屬南陽醫院 南陽市中心醫院神經外科，河南 南陽 473000)

目的探討神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路活化的上游影響因素。方法選擇SH-SY5Y為靶細胞，首先用MAPK信號通路上游抑制劑處理細胞，待細胞培養1 h之后，加入Aβ42纖維聚集體，細胞培養24 h后進行檢測。首先采用甲氮甲唑藍(MTT)法測定了細胞的存活率，然后利用Western印跡檢測磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶(p-ERK)和ERK的蛋白表達水平，從而檢測MAPK信號通路的激活水平。結果用鋸鱗血抑肽或α1整合素蛋白封閉性抗體可以有效抑制Aβ引起的細胞死亡，并且阻止Aβ成纖維誘導MAPK的激活水平的提高(P<0.05)。用α1和β1整合素蛋白封閉抗體同時作用細胞時，得到了相似的結果。但是如果只用β1整合素蛋白封閉抗體單獨作用細胞時，不能阻止Aβ成纖維誘導細胞死亡和MAPK的激活水平的提高。結論α1整合素，α1和β1整合素復合體是Aβ誘導SH-SY5Y細胞中MAPK信號通路激活從而介導細胞死亡的重要因素。推測α1整合素蛋白和α1、β1復合體可以作為治療性干擾Aβ信號通路的靶點。

整合素；黏著斑激酶；神經突變性；細胞死亡

淀粉樣蛋白(Aβ)在細胞外的沉積與tau蛋白的過度磷酸化有著密不可分的關系。研究發現，Aβ在作用多種細胞引入神經毒性的同時伴隨著絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活〔1〕。同時，當成熟的海馬神經元與MAPK抑制因子共同孵育，可以抑制tau蛋白的過度磷酸化和神經突觸退變〔2〕。本文采用了α1整合素蛋白抑制因子，β1整合素蛋白抑制因子和α1、β1整合素復合物蛋白抑制因子分別作用細胞，從而進一步研究這些整合素蛋白在Aβ誘導MAPK信號通路激活中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 Aβ(1～42)肽、六氟異丙醇(HFIP)購自Sigma公司；整合素α1封閉抗體(α1整合素抑制劑)和整合素β1封閉抗體(β1整合素抑制劑)購自Santa Cruz；鼠抗人細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)抗體和兔抗人p-ERK抗體購自Santa Cruz；鼠抗人黏著斑激酶(FAK)抗體和兔抗人p-FAK抗體購自Santa Cruz；抗兔IgG(抗p-ERK抗體和抗p-FAK抗體)和抗鼠IgG(抗ERK抗體和抗FAK抗體)購自Santa Cruz；Tubulin購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的增強型化學發光試劑(碧云天)；甲氮甲唑藍(MTT)購自Sigma公司；鋸鱗血抑肽(E)購自Sigma公司；SH-SY5Y細胞購于German Collection of Microorganisams and Cell Cultures;青霉素和鏈霉素購自Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養基購于GIBCO。

1.2細胞培養 神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)培養于添加10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養液中，放入5%CO2，37℃培養箱中培養。待細胞長到80%左右進行細胞傳代培養，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗除去未貼壁的細胞，加入1 ml 0.25%的胰蛋白酶室溫消化，細胞變圓后用彎頭滴管加入新鮮的培養液吹打瓶壁進行細胞重懸，按1∶3比例進行傳代以備后續實驗所用。根據所做實驗對細胞量的要求計數后分別把細胞傳到培養瓶，96孔板、24孔板或6孔板進行培養。

1.3Aβ纖維聚集體的制備及鑒定 將Aβ1～42無菌條件下溶解于1 mg/ml的HIFP，水浴超聲10 min，真空干燥，-20℃凍存。使用時現將Aβ42用二甲基亞砜(DMSO)溶解至1 mg/ml，再將Aβ42稀釋到終濃度為10 μmol/L的PBS中，終濃度為20 mol/L，在37℃孵育6 d形成纖維聚集狀態。然后通過透射電子顯微鏡觀察確認其聚集狀態。Aβ42纖維聚集體的制備和聚集體結構的透射電鏡形態參考文獻〔3〕。由于Aβ42形成聚集體的不可逆性，Aβ42纖維的使用均為先用先制備，若短期使用置于-80℃儲存。

1.4MTT法檢測細胞的存活率 取對數生長期細胞，以每孔 2×103個細胞(100 μl)的數量接種在96孔板培養24 h，根據實驗要求分別將鋸鱗血抑肽(整合素的一個抑制子)，α1整合素抑制劑，β1整合素抑制劑，α1+β1整合素抑制劑加入不同的培養孔中(設置兩組平行實驗：實驗組1和實驗組2)，終濃度為2 μmol/L，5%CO2條件下培養1 h。向實驗組1和實驗組2中分別加入相同體積的Aβ纖維聚集體和含10%胎牛血清的DMEM。其中，實驗組1中Aβ纖維聚集體的終濃度為20 μmol/L，5%CO2條件下培養24 h。同時設置不含有整合素抑制劑、Aβ纖維聚集體和只加入20 μmol/L Aβ纖維聚集體的對照實驗組。細胞在處理完畢后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續培養4 h，吸出培養液，加入DMS 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標儀(Bio-Tek,ELX800)在波長490 nm處讀取吸光度(A490)值。

1.5抑制整合素的活性 首先，將鋸鱗血抑肽(整合素的一個抑制子)加入達到對數生長期的SH-SY5Y細胞中，調節終濃度2 μmol/L，孵育1 h后時加入Aβ纖維聚集體(20 μmol/L)，孵育24 h。另設一實驗組，將鋸鱗血抑肽換成整合素封閉抗體作用于達到對數生長期的SH-SY5Y細胞，調節終濃度2 μmol/L，孵育1 h時后加入Aβ纖維聚集體(20 μmol/L)，孵育24 h。通過MTT實驗和免疫印跡實驗分別檢測細胞的存活率和分析蛋白ERK和p-ERK的表達量。

1.6Western印跡檢測目的蛋白 SH-SY5Y細胞經2 μmol/L鋸鱗血抑肽，2 μmol/L α1整合素抑制劑，2 μmol/L β1整合素抑制劑，2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素抑制劑作用1 h和2 μmol/L鋸鱗血抑肽，2 μmol/L α1整合素抑制劑，2 μmol/L β1整合素抑制劑，2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素抑制劑作用1 h，20 μmol/L Aβ纖維聚集體作用24 h后 ，提取細胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質濃度。各組取50 μg總蛋白上樣，經 12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，80 V轉膜 90 min。5%脫脂牛奶-PBST 封閉 2 h；分別加入以下一抗：ERK(1∶800)，p-ERK(1∶1 000)，FAK(1∶800)，p-FAK(1∶1 000)和Tubulin(1∶5 000 稀釋)，4℃搖床上孵育過夜。次日洗膜，加入二抗(羊抗兔和羊抗鼠，1∶10 000 稀釋)，室溫孵育2～3 h。洗膜后，采用辣根過氧化物酶標記的增強型化學發光法顯色，顯影于X光片上。采用 LabWorks4.6軟件對目的蛋白和Tubulin 條帶行灰度值分析。

1.7統計學方法 使用SPSS軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1鋸鱗血抑肽對Aβ42纖維誘導SH-SY5Y細胞死亡的影響 以20 μmol/L Aβ42纖維處理細胞24 h后，與未經處理的細胞相比，細胞的存活率明顯降低。如果用2 μmol/L的鋸鱗血抑肽作用細胞1 h，20 μmol/L的Aβ42纖維處理細胞24 h后，細胞的存活率(73.54±0.02)與單獨用20 μmol/L Aβ42纖維作用的對照組(29.23±0.01)相比發生明顯提高，這說明通過抑制MAPK信號通路可以有效抑制Aβ42纖維所誘導的細胞死亡。

2.2MAPK在SH-SY5Y中的表達水平 與對照組(鋸鱗血抑肽和Aβ42纖維聚集體濃度為0)比較，單獨用Aβ42纖維聚集體作用細胞24 h后，細胞中p-ERK水平要高于對照組(54.32±0.001)%(P<0.05)。用2 μmol/L鋸鱗血抑肽單獨作用細胞1 h，用2 μmol/L鋸鱗血抑肽和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體分別作用細胞1 h和24 h后，細胞中p-ERK水平相近，分別為(49.84±0.01)%和(55.47±0.02)%均低于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 鋸鱗血抑肽(E)抑制Aβ誘導 SH-SY5Y細胞中MAPK的激活

2.3MTT檢測整合素封閉抗體對SH-SY5Y細胞存活率的影響 當以20 μmol/L Aβ42纖維聚集體為細胞胞外基質作用細胞24 h，細胞的存活率為對照組的(0.30±0.01)倍(P<0.05)。所得的實驗結果與2 μmol/L β1整合素封閉抗體和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體分別作用細胞1 h和24 h得到的實驗結果相近。但是，如果單獨用2 μmol/L β1整合素封閉抗體作用細胞1 h，細胞的存活率為照組的(0.70±0.02)倍(P<0.05)。明顯高于以Aβ42纖維聚集體，β1整合素封閉抗體和Aβ42纖維聚集體為胞外基質時細胞的存活率。用2 μmol/L α1整合素封閉抗體孵育細1 h，2 μmol/L α1整合素封閉抗體孵育細胞1 h和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體孵育細胞24 h得到的細胞存活率分別為照組的(0.80±0.02)倍和(0.77±0.03)倍(P<0.05)。與β1整合素封閉抗體單獨作用細胞得到的結果相似。當用2 μmol/L α1整合素封閉抗體和β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h所得的結果與用2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體孵育細胞24 h得到的細胞存活率相近，分別為照組的(0.99±0.03)倍和(0.97±0.03)倍(P<0.05)。

2.4α1整合素在Aβ42寡聚體所誘導MAPK激活中的作用 獨用Aβ42(20 μmol/L)作用細胞24 h后，細胞中p-ERK的蛋白表達量最高，而用2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h后，細胞中p-ERK的蛋白表達量最低。以p-ERK/ERK的蛋白比值為標準，各組數據分別為100%，(149.23±0.01)%，(48.34±0.02)%,(45.45±0.02)%，(47.21±0.03)%，(45.67±0.01)%，(19.45±0.04)%，(21.54±0.02)%。見圖2。

FAK通常與整合素共定位，并通過與特異性的配體結合而活化。活化的FAK中397位的酪氨酸會發生磷酸化。根據免疫印跡的實驗結果，發現實驗組的FAK磷酸化水平與對照組相比沒有明顯變化。見圖3。

圖2 整合素封閉抗體抑制Aβ誘導 SH-SY5Y細胞中MAPK的激活

圖3 Aβ42纖維對SH-SY5Y中FAK活化水平的影響

3 討 論

整合素是細胞表面受體的主要家族。對細胞和細胞外基質的黏附起介導作用。在受損傷的神經細胞中發現淀粉樣前體蛋白(APP)和整合素在神經細胞中有共定位。例如，在海馬神經元中，APP與α1β1整合素異二聚體存在共定位。整合素異二聚體是由α1，α3，α5，α6和β1整合素所形成的〔4〕。Bi等〔5〕研究表明，抑制海馬神經元整合素的表達將會引起Aβ的大量積累，對不同的細胞模型進行研究時發現，整合素在Aβ介導的細胞凋亡過程中也起到重要的作用。在神經膠質細胞中，通過對β1整合素的抑制可以抑制Aβ刺激產生的活性氧〔6〕。在成熟的神經細胞中，Aβ纖維引起MAPK活化的峰值在細胞暴露給Aβ纖維24 h之后，這與生長因子所引起的瞬間激活不同〔7〕。同時在MAPK激活之后的1 h仍然處于活化狀態〔8〕。這表明Aβ引起的MAPK活的活化是漸進的并且具有持續性。這種MAPK的激活模式是由于細胞外基質中的蛋白與細胞上的受體結合所介導的。Zhu等〔9〕研究發現纖連蛋白與3T3細胞的整合素結合可以引發MAPK持久性激活。

本研究結果表明MAPK在Aβ42誘導的神經細胞死亡過程中發揮用。實驗中所采用的MAPK抑制劑-鋸鱗血抑肽是通過抑制整合素的活化從而抑制MAPK信號通路的活化。這表明整合素蛋白在Aβ42介導的MAPK信號通路活化的過程中發揮作用。為了進一步確定發揮作用的整合素蛋白，分別采用α1整合素抑制劑，β1整合素的抑制，α1+β1整合素抑制劑，Aβ42纖維分別作用細胞。結果發現，α1整合素抑制劑和α1+β1整合素抑制劑可以有效降低Aβ42纖維所誘導產生的細胞死亡，但是單獨用β1整合素抑制劑作用細胞將不會有效降低細胞的死亡率。通過進一步檢測不同實驗條件下MAPK通路的活化程度，發現當用α1、β1、α1+β1整合素抑制劑分別作用細胞時，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值明顯降低，這說明細胞中MAPK信號通路的激活被抑制。如果在加入α1、α1+β1整合素抑制劑后，用Aβ42纖維聚集體作用細胞，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值也發生明顯降低。其中以α1+β1整合素抑制劑為胞外基質與以α1+β1整合素抑制劑和Aβ42纖維聚集體為胞外基質時，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值最低。這說明α1整合素和α1+β1整合素復合體對MAPK信號通路的激活具有十分重要的作用。而如果先后以β1整合素抑制劑和Aβ42纖維聚集體作用細胞，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值與對照組相比變化不大。這說明單獨的β1整合素對Aβ42纖維誘導MAPK信號通路激活導致細胞死亡的過程中沒有發揮顯著作用。

對于Aβ激活α1整合素的分子機制至今仍然不清楚。其中一個可能的機制是Aβ直接與整合素相結合。這種結合可能是由Aβ的5～8個氨基酸所介導的。 這個序列包含了一個潛在的整合素結合位點(RHDS)〔10〕。另一種方式可能是Aβ可以間接結合到整合素上。整合素可能是Aβ纖維與細胞表面受體分子作用的一部分〔11〕。最近在神經膠質細胞中得到了這種機制的證據。Aβ纖維黏附到神經膠質細胞是由CD36，CD37和α6整合素異二聚體形成的復合物所介導的〔12〕。但是對于這種Aβ接受子復合物的了解不是很充分，不過最近有研究表明NMDA接受子也和整合素一樣在Aβ介導的神經毒性中有著重要的作用。

Zhang等〔13〕發現當培養的神經元暴露在Aβ(1～42)和Aβ(25～35)的條件下，FAK的磷酸化水平上升。但是根據本研究結果，與Aβ共同孵育的SH-SY5Y細胞中磷酸化的FAK水平并沒有升高。這可能是由于所采用的細胞系不同，導致實驗結果出現不同。但是對于FAK的具體變化我們仍然需要更多的實驗證據。

1Rapoport M,Ferreira A.PD98059 prevents neurite degeneration induced by fiorllar beta-amyloid in mature hippocampal neurons〔J〕.J Neurochem,2000;74(1):125-33.

2Rapoport M,Dawson HN,Binder LI,etal.Tau is essential to beta-amyloid-induced neurotoxicity〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2002;99(9):6364-9.

3Zhu X,Ye L,Ge H,etal.Hopeahainol A attenuates memory deficits by targeting β-amyloid in APP/PS1 transgenic mice〔J〕.Aging Cell,2013;12(1):85-92.

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5Bi X,Gall CM,Zhou J,etal.Uptake and pathogenic effects of amyloid beta peptide 1-42 are enhanced by integrin antagonists and blocked by NMDA receptor antagonists〔J〕.Neuroscience,2002;112(4):827-40.

6Wei ZJ,Tao ML,Zhang W,etal.Up-regulation of microRNA-302a inhibited the proliferation and invasion of colorectal cancer cells by regulation of the MAPK and PI3K/Akt signaling pathways〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(5):4481-91.

7Wang S,Zhang C,Sheng X,etal.Peripheral expression of MAPK pathways in Alzheimer's and Parkinson's diseases〔J〕.J Clin Neurosci,2014;21(5):810-4.

8Feld M,Krawczyk MC,Sol Fustiana M,etal.Decrease of ERK/MAPK overactivation in prefrontal cortex reverses early memory deficit in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2014;40(1):69-82.

9Zhu X,Assoian RK.Integrin-dependent activation of MAP kinase:a link to shape-dependent cell proliferation〔J〕.Mol Biol Cell,1995;6(3):273-82.

10Sabo S,Lambert MP,Kessey K,etal.Interaction of beta-amyloid peptides with integrins in a human nerve cell line〔J〕.Neurosci Lett,1995;184(1):25-8.

11廖 鋒,李 友,趙 斌.去整合素和金屬蛋白酶10與阿爾茲海默病的研究進展〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版),2013;7(6):2653-6.

12Bamberger ME,Harris ME,McDonald DR,etal.A cell surface receptor complex for fibrillar beta-amyloid mediates microglial activation〔J〕.J Neurosci,2003;23(7):2665-74.

13Zhang B,Bian X,He P,etal.The toxicity mechanisms of action of Aβ25-35 in isolated rat cardiac myocytes〔J〕.Molecules,2014;19(8):12242-57.

〔2017-02-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

R74

A

1005-9202(2017)18-4486-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.024

齊平建(1971-)，男，主任醫師，主要從事神經外科研究。

王華民(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經外科研究。