肥大細胞膜穩定劑對大鼠糖尿病心肌病變的影響

劉 飛 古遠云 李 程 趙 婭 徐 勇 萬 沁

(瀘州醫學院附屬醫院內分泌科，四川 瀘州 646000)

肥大細胞膜穩定劑對大鼠糖尿病心肌病變的影響

劉 飛 古遠云 李 程 趙 婭 徐 勇 萬 沁

(瀘州醫學院附屬醫院內分泌科，四川 瀘州 646000)

目的研究肥大細胞膜穩定劑酮替芬對大鼠糖尿病心肌病(DCM)的影響及可能機制。方法將45只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、DCM組和肥大細胞膜穩定劑組(Ket組)。NC組給予普通飲食，DCM組予以高脂高糖飲食加一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DCM大鼠模型，Ket組為DCM大鼠模型建模成功后給予0.025%的酮替芬溶液1 mg/kg腹膜腔內注射，2次/d，連續注射8 w。同時，NC組和DCM組給予等體積的生理鹽水空白對照注射。實驗完成后處死全部大鼠，剪下左心室，稱取左心室重量計算全心指數和左心室重量指數，在電鏡下對各組心肌組織進行觀察分析，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、活性氧簇(ROS)表達，甲苯胺藍改良染色法比較肥大細胞數量分布。結果DCM組全心指數顯著高于NC組和Ket組(均P<0.05)；DCM組左心室重量指數顯著高于NC組和Ket組(均P<0.05)。電鏡下NC組大鼠心肌細胞核橢圓形清晰可見，閏盤連續，肌絲致密，胞內可見大量形態結構正常的線粒體；DCM組大鼠心肌細胞核固縮，線粒體腫脹，顯示不清晰，閏盤扭曲斷裂，肌絲溶解；Ket組大鼠心肌細胞核無明顯腫脹，核膜尚光滑、完整，無核固縮表現，線粒體完整清晰。DCM組大鼠血清TNF-α、ROS顯著高于NC組和Ket組(均P<0.05)。DCM組大鼠心肌組織中肥大細胞分布密度顯著高于NC組和Ket組。結論糖尿病大鼠心肌組織存在肥大細胞的表達增強，肥大細胞膜穩定劑酮替芬可減輕DCM。肥大細胞表達的增強可促進TNF-α和ROS的表達，部分參與DCM的發生發展。

糖尿病心肌病；肥大細胞；酮替芬

糖尿病心肌病(DCM)是2型糖尿病(T2DM)患者重要的致死原因之一〔1〕。目前DCM的發病機制尚未完全清楚。研究表明DCM的發病與氧化應激、炎癥反應、胰島素抵抗等因素有關〔2〕。肥大細胞作為一種多功能的炎癥細胞，近年來在糖尿病及其并發癥的發生發展中的作用受到廣泛關注。本研究旨在探討肥大細胞在大鼠DCM發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1動物模型制備及分組 8周齡雄性Wistar大鼠50只(重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司)，體重180～200 g，適應性喂養2 w后，隨機選取其中35只大鼠用于T2DM大鼠造模，留15只大鼠作為正常對照組(NC組)。NC組繼續給予普通飲食喂養，T2DM造模組給予高脂高糖飲食，喂養6 w后，用鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg(用前以pH4.2的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度)一次性腹腔注射，NC組僅注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液作為對照。72 h后造模組大鼠尾靜脈取血測空腹血糖(FPG)，≥16.7 mmol/L視為T2DM大鼠造模成功，其中31只造模成功。將31只造模成功的大鼠隨機選取30只，隨機將其分為DCM組15只和肥大細胞膜穩定劑干預組(Ket組)15只，DCM和Ket兩組繼續給予高脂高糖飲食喂養，同時NC組給予普通飲食喂養，4 w后測量三組大鼠體重，Ket組每只大鼠給予0.025%的酮替芬溶液1 mg/kg腹膜腔內注射，2次/d，NC組和DCM組給予等體積的生理鹽水空白對照注射。

1.2方法

1.2.1取材及病理學觀察 繼續喂養大鼠8 w后處死，分離取下心臟，稱量全心重量，然后剪下左心室，稱取左心室重量計算全心指數(全心重/體重，HW/BW)和左心室重量指數(左心室重量/體重，LVW/BW)，最后用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚度2 μm。按常規取材制作左心室透射電鏡的超微結構標本，用電鏡觀察心肌組織病變。

1.2.2肥大細胞染色及計數 采用甲苯胺藍改良染色法。將左心室心肌組織于4%甲醛液固定24 h后，系列乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。4 μm連續石蠟切片，脫蠟至水，置甲苯胺藍液(質量濃度為0.5 g/L)40 min，水洗1～2 min后以0.5%冰醋酸分化，至胞核和顆粒清晰(鏡控)，水洗2 min，冷風吹干，中性樹膠封固。隨機連續計數5個視野(×200)內肥大細胞數，取其平均值。

1.2.3腫瘤壞死因子(TNF)-α和活性氧簇(ROS)的檢測 從大鼠心臟取血，3 000 r/min離心10 min，將血清和血細胞迅速小心地分離，再嚴格按照大鼠TNF-α和ROS酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒說明書步驟進行，檢測ROS和TNF-α在450 nm處各孔的吸光度(OD 值)。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1各組全心指數和左心室重量指數比較 DCM組全心指數、左心室重量指數顯著高于NC組和Ket組(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠血清TNF-α和ROS比較 DCM組血清TNF-α、ROS水平明顯高于NC組和Ket組(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠心肌細胞超微結構比較 電鏡下可見NC組心肌細胞核橢圓形清晰可見，閏盤連續，肌絲致密，胞內可見大量形態結構正常的線粒體；DCM組心肌細胞核固縮，線粒體腫脹，顯示不清晰，閏盤扭曲斷裂，肌絲溶解；Ket組心肌細胞核無明顯腫脹，核膜尚光滑、完整，無核固縮表現，線粒體完整清晰。見圖1。

2.4各組大鼠心肌組織肥大細胞分布比較 DCM組肥大細胞數量〔(3.9±0.34)個/mm2〕顯著高于NC組〔(1.8±0.27)個/mm2〕及Ket組〔(2.5±0.53)/個mm2,P<0.05〕。

表1 各組體重、全心指數和左心室重量指數及大鼠血清TNF-α和ROS比較

與DCM組比較：1)P<0.05

圖1 各組左心室心肌組織電鏡圖(×10 000)

3 討 論

T2DM可引起心臟微血管病變、心肌代謝紊亂和心肌纖維化等所致的心肌廣泛結構異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態。炎癥反應、氧化應激、胰島素抵抗等被認為是DCM發病的重要因素。

肥大細胞作為一種重要的炎癥細胞，研究發現它可通過釋放各種介質促進TNF-α的釋放，而TNF-α為一種重要的炎癥介質，可以通過還原型輔酶Ⅱ氧化酶增加心肌細胞ROS的產生〔3～5〕。ROS作為反映氧化應激狀態的標志〔6〕，可通過以下5種途徑造成心肌肥厚、纖維化、左心室功能損傷，促進DCM的進展。①通過激活PKC途徑，導致心臟中晚期糖基化終末產物生成增加〔7〕。②激活內質網應激〔8〕。③直接氧化蛋白質和脂質引起細胞蛋白或磷脂損壞。④參與DNA損傷，尤其是對線粒體DNA的損害。通過使DNA鏈斷裂，激活多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，PARP過度激活導致細胞內NAD耗竭，細胞氧化還原進一步失衡。⑤產生過氧亞硝基鹽陰離子，細胞內的亞硝基化，進一步損傷線粒體呼吸鏈功能。

本研究顯示，DCM發病與肥大細胞活化相關，肥大細胞膜穩定劑酮替芬可通過抑制肥大細胞的活化減低TNF-α等炎癥因子的釋放，TNF-α的降低也一定程度上減少ROS的生成，從而減弱心肌組織炎癥反應和氧化應激反應，進而對DCM起到一定的干預治療作用。

1Xu Y，Wang L，He J，etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults〔J〕.JAMA，2013；310(9)：948-59.

2Goyal BR，Mehta AA.Diabetic cardiomyopathy pathophysiological mechanisms and cardiac dysfunction〔J〕.Hum Exp Toxicol，2013；32(6)：571-90.

3Westermann D，Van Linthout S，Dhayat S，etal.Tumor necrosis factor-alpha antagonism protects from myocardial inflammation and fibrosis in experimental diabetic cardiomyopathy〔J〕.Basic Res Cardiol，2007；102(6)：500-7.

4Ti Y，Xie G，Wang Z，etal.TRB3 gene silencing alleviates diabetic cardiomyopathy in a type 2 diabetic rat model〔J〕.Diabetes，2011；60(11)：2963-74.

5Swindle EJ，Metcalfe DD，Coleman JW.Rodent and human mast cells produce functionally significant intracellular reactive oxygen species but not nitric oxide〔J〕.J Biol Chem，2004；279(47)：48751-9.

6Stolen TO，Hoydal MA，Kemi OJ，etal.Interval training normalizes cardiomyocyte function，diastolic Ca2+control and SR Ca2+release synchronicity in a mouse model of diabetic cardiomyopathy〔J〕.Circ Res，2009；105(6)：527-36.

7Willemsen S，Hartog JWL，Hummel YM，etal.Tissue advanced glycation end products are associated with diastolic function and aerobic exercise capacity in diabetic heart failure patients〔J〕.Eur J Heart Fail，2011；13(1)：76-82.

8Li J，Zhu H，Shen E，etal.Deficiency of rac1 blocks NADPH oxidase activation，inhibits endoplasmic reticulum stress and reduces myocardial remodeling in a mouse model of type 1 diabetes〔J〕.Diabetes，2010；59(8)：2033-42.

〔2016-05-07修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R589

A

1005-9202(2017)18-4496-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.028

萬 沁(1971-)，女，教授，碩士，主要從事糖尿病大血管并發癥研究。

劉 飛(1987-)，男，醫師，碩士，主要從事糖尿病大血管并發癥研究。