早期針刺對創傷性腦損傷大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影響*

杜若桑 苑鴻雯 鄭淑美 王寶華 崔 海（首都醫科大學，北京 100069）

·實驗報告·

早期針刺對創傷性腦損傷大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影響*

杜若桑 苑鴻雯 鄭淑美 王寶華 崔 海△（首都醫科大學，北京 100069）

目的 觀察針刺對創傷性腦損傷（TBI）大鼠血清膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和S-100B蛋白水平的影響，評估針刺對創傷性腦損傷的療效。方法 按隨機數字表法隨機將120只雄性SD大鼠隨機分成3組，每組40只：假手術組、模型組、針刺組。假手術組只開骨窗，不進行模型制備；模型組和針刺組制備TBI模型；針刺組造模后即接受針刺治療，每日1次。術后6 h、1 d、3 d、5 d 4個時間點每組均隨機選出10只大鼠進行血清GFAP、S-100B蛋白水平和改良的神經功能缺損（mNSS）評分觀察與檢測。結果 相較假手術組，模型組6 h即檢測到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高（P＜0.01）。傷后6 h、1 d檢測發現針刺組GFAP水平比同期模型組降低（P＜0.05），傷后6 h、1 d、3 d檢測發現針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著降低（P＜0.01）。4個檢測時間點上，模型組大鼠mNSS評分均高于同期假手術組（P＜0.01），針刺組評分顯著低于同期模型組（P＜0.05或P＜0.01）。結論 TBI早期采用針刺干預可明顯減輕大鼠腦損傷的程度。

創傷性腦損傷 針刺 GFAP S-100B蛋白 mNSS評分

創傷性腦損傷（TBI）是指因外力導致的腦部損傷。據統計，TBI發生率居外傷首位，也是外傷患者殘疾甚至死亡的主要原因之一［1］。全球范圍內每年有1千萬以上的人因為TBI入院治療甚至死亡［2］。TBI還是40歲以下人群殘疾的首要原因［3］。TBI會導致運動、感覺、認知、精神障礙等問題，其中很多損害是終身性的［4］。TBI還有可能引起種種退行性疾病，如慢性創傷性腦病、阿爾茲海默病、帕金森病［5］。Hyder等預測到2020年TBI將成為全球第3大疾病負擔［6］。目前缺乏對TBI安全而有效的藥物治療［7］，尋求探索可治療TBI的治療措施具有重大意義。有相當數量的臨床研究顯示單獨針灸治療或配合其他療法對于TBI急性期或恢復期意識、肢體運動、認知、精神等障礙有確切療效［8］。血清膠質纖維酸性蛋白 （GFAP）和S-100B蛋白對TBI有高度敏感性和特異性，TBI發生后，血液中的GFAP和S-100B蛋白水平可反映腦組織的損傷程度。本課題組觀察了針刺對TBI大鼠行為學和血清中 GFAP、S-100B蛋白水平的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠120只，體質量200～300 g，由首都醫科大學實驗動物中心提供、飼養，室溫溫度（23±2） ℃，12/12 h 光照周期模擬晝夜交替，標準飼料喂養，自由飲水，將大鼠適應性喂養7 d后再進行試驗。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》中的規定。

1.2 試劑和儀器 腦立體定位儀（68025，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA），電熱恒溫培養箱（DH4000A，天津泰斯特），MINI shaker （MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），Rat GFAP ELISA KIT（上海藍基生物科技有限公司），Rat S100B ELISA KIT（上海藍基生物科技有限公司），水合氯醛（F20080911，國藥集團化學試劑有限公司批號），一次性無菌針灸針（直徑0.30 mm，長 25 mm，華佗牌）。

1.3 分組與造模 按隨機數字表法，將120只大鼠隨機分成3組，每組40只：假手術組、模型組、針刺組，每組根據傷后不同時間點再隨機平均分成4個亞組：6 h組、1 d組、3 d組和5 d組。以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質量）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠以俯臥位固定于腦立體定位儀，頭部備皮消毒后，在其眼睛后方沿頭部正中線做長約1.5 cm的縱行切口，暴露前囟。并以大鼠左側腦半球，前囟旁開2.5 mm，向后1.5 mm處為圓心，用牙科鉆鉆出直徑4 mm的圓形骨窗，避免大鼠硬腦膜受損。參考Feeney法［9］自制自由落體打擊器進行撞擊造模：將40 g的砝碼自40 cm高處自由落體撞擊打擊大鼠硬腦膜。打擊后清理創口，并在切口內滴注4萬U硫酸慶大霉素0.2 mL以抗感染，將骨瓣還納于骨窗中，并用骨蠟封閉。縫合頭皮后將大鼠單籠飼養。假手術組：假手術組只開骨窗，不進行TBI模型制備。抗感染骨瓣還納封閉同針刺組。

1.4 干預方法 針刺組于TBI造模后即針刺大鼠雙側風池穴、水溝穴、雙側內關穴1次，直刺進針約2～3 mm，穴位依照《大鼠穴位圖譜的研制》［10］進行定位。風池、內關連接電針儀，電針參數采用疏密波波形，頻率為2～10 Hz，電流強度0.1～0.3 mA，治療每日1次，每次15 min。針刺組4個亞組（術后6 h組、1 d組、3 d組、5 d 組）各接受針刺治療 1、1、3、5 次。

1.5 標本采集與檢測 術后6 h、1 d、3 d、5 d 3個時間點每組均隨機選出10只大鼠進行下列指標的觀察與檢測。1）血清GFAP、S-100B蛋白水平。mNSS評分后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，每只大鼠均進行腹主動脈采血5 mL取血清，以ELISA法，按試劑盒說明檢測大鼠血清中GFAP、S-100B蛋白水平。2）改良的神經功能缺損評分（mNSS）。mNSS評分包含運動、感覺（視覺、觸覺、本體感覺）、反射和平衡測試［11］。 滿分為18分，分數越高代表神經損傷功能越嚴重。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以±s）表示，同期組間數據采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清GFAP水平比較 見表1。根據模型組數據，傷后6 h即發現血清GFAP水平升高，隨后其水平下降，但傷后1 d仍顯著高于同期假手術組。傷后6 h、1 d檢測發現針刺組GFAP水平比同期模型組減低（P＜0.05），和假手術組無明顯差異（P＞0.05）。傷后 3 d和5 d時，各組同期數據相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS評分比較（

表1 各組GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS評分比較（

與假手術組同期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 時 間 mNSS評分假手術組 6 h 1.30±0.95（n＝10） 1 d 1.10±0.57 3 d 0.30±0.68 GFAP（ng/mL）S-100B 蛋白 （ng/mL）0.89±0.12 0.73±0.30 0.83±0.18 0.73±0.30 0.80±0.19 0.71±0.24 0.79±0.25 0.55±0.14模型組 6 h 1.21±0.18** 1.21±0.14** 11.40±1.65**5 d 0.10±0.32（n＝40） 1 d 1.17±0.19** 1.37±0.19** 9.20±1.69**3 d 0.87±0.22 1.47±0.18** 7.20±1.99**5 d 0.85±0.25 1.02±0.30** 5.60±2.37**針刺組 6 h 0.96±0.18△ 0.91±0.26△△ 9.65±1.65**△△（n＝40） 1 d 0.85±0.23△ 0.78±0.36△△ 6.50±0.85**△△3 d 0.82±0.17 0.75±0.28△△ 3.10±1.20**△△5 d 0.83±0.19 0.71±0.27 3.30±1.16**△

2.2 各組S-100B蛋白水平比較 見表1。根據模型組數據，大鼠傷后6 h即檢測到血清S-100B蛋白水平升高，數值最高峰出現在3 d，到5 d仍維持在較高水平。傷后6 h、1 d、3 d檢測發現針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著減低（P＜0.01），和假手術組無明顯差異（P＞0.05）。傷后5 d時，針刺組和其余兩組差異無統計學意義（P＞0.05），但數值明顯低于模型組。2.3 各組mNSS評分比較 見表1。經統計分析后發現，傷后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型組 mNSS 評分均顯著高于假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。而針刺組mNSS評分雖然高于同期假手術組（P＜0.01），但顯著低于同期模型組（P＜0.05或P＜0.01），從數值上看針刺組數值顯著低于同期的模型組。

3 討 論

TBI可對人體產生諸多損害，根據損傷發生的時間，TBI可分為原發性腦損傷和繼發性腦損傷。原發性腦損傷是指外力對神經、血管等組織造成的直接損傷，發生于損傷當時，立刻產生臨床效應，往往是不可逆轉的。繼發性腦損傷是隨后發生的，主要是指顱內血腫和腦水腫，興奮性谷氨酸毒性、炎性反應、氧自由基、Ca2+超載、缺血再灌注等病理性損害會導致一系列繼發性損傷。諸多動物、臨床研究已證實針灸對本病的療效。

血清中可作為TBI標志物的幾種蛋白一直受到廣泛的關注，它們可以早期、高效地判斷評估TBI病情、治療效果和預后，其中GFAP和S-100B蛋白就是研究熱度高的兩種蛋白［12］。 夏小輝等［12］研究發現 TBI患者血清中GFAP、S-100B蛋白水平均在第2天達峰值，第4～6天進入平臺期，S-100B蛋白和GFAP水平均與其病情嚴重程度和Marshall CT分類呈正相關，與腦組織損傷的嚴重程度關系密切，聯合動態監測這2個指標對TBI患者的診斷及病情評估具有重要的臨床參考價值。

GFAP是單節顯性的中間絲狀蛋白，特定地表達在星形膠質細胞中，是細胞骨架的主要組成部分［13］。它和反應性星形細胞增生密切相關，反應型星型細胞增生的典型表現是星形膠質細胞增生或肥大，是許多中樞神經系統疾病的主要病理現象。眾多研究顯示受損組織局部GFAP免疫反應活性的增強是神經元損傷的靈敏指標，也是星形膠質細胞增生活躍的敏感指標之一。在創傷或疾病導致的腦組織或脊髓細胞受損情況下血清 GFAP水平出現上升［14］，GFAP是 TBI損傷早期的可靠診斷依據之一，也和TBI嚴重程度和死亡率的有密切關系。Missler等通過對重型腦外傷患者的血清GFAP研究后發現，傷后3 h內，其血清中的GFAP水平即明顯升高，損傷發生6 h后GFAP水平顯著下降［15］。Cikriklar等研究發現腦外傷大鼠造模后2 h血清GFAP的升高和創傷的嚴重程度成正比［16］。Huang等采集了TBI大鼠傷后3 h、6 h、24 h后的血清，發現在傷后第3小時和6 h兩個時間點上，血清中的GFAP含量均顯著上升，但傷后24 h時GFAP和正常時無差異［17］。方永軍等發現TBI大鼠血清GFAP含量在術后均有升高，術后第1天開始明顯升高，至第7天達峰值，后逐漸下降，至第14天仍明顯高于假手術組［18］。黃培贊等檢測了大鼠TBI造模后1 h、6 h、24 h時的血清GFAP的含量，發現隨著時間推移，其表達越來越高［19］。

S-100B蛋白也是一種TBI的特定的生物學標記［20］，也是近年來TBI標志物研究的熱點之一［21］。S-100B蛋白屬于鈣結合蛋白家族，主要分布于星形膠質細胞和施旺細胞［22］，它參與調節復雜的神經元-神經膠質反應［13］，在TBI后通過破壞的血腦屏障進入血液。郭新榮等研究發現大鼠腦損傷發生后血清S-100B含量顯著上升，表現為傷后第1天、第2天、第3天其含量逐步上升［23］。還有研究發現TBI大鼠血清S-100B蛋白水平在傷后6 h開始升高，24 h達高峰，72 h基本回復正常水平［24］。大鼠血清S-100B蛋白濃度在腦外傷后立即升高，并在第24小時達到高峰，此后雖有緩慢下降但直至傷后第7天仍保持在較高水平［25］。

本研究發現，TBI傷后6 h即檢測到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高，GFAP峰值出現在傷后6 h，S-100B蛋白出現在第3天。第3天和第5天TBI大鼠GFAP和假手術組大鼠無異，但TBI大鼠S-100B蛋白水平直到第5天仍保持在較高水平。驗證了相關研究所說的TBI早期可應用GFAP和S-100B蛋白評估TBI病情、治療效果和預后。傷后6 h、1 d檢測發現針刺組GFAP水平比同期模型組降低，傷后6 h、1 d、3 d檢測發現針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著減低，說明早期針刺可減輕TBI大鼠的腦損傷。再結合mNSS 評分， 傷后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型組 mNSS 評分均顯著高于假手術組，說明TBI造模后，大鼠有顯著的神經功能受損。而針刺組mNSS評分雖然高于同期假手術組，但顯著低于同期模型組，從數值上看針刺組數值顯著低于同期的模型組，說明針刺能改善TBI后神經功能損傷。以上數據從mNSS評分、GFAP和S-100B蛋白水平血清角度證實TBI早期采用針刺干預可取得不錯的療效治療，可明顯減輕大鼠腦損傷的程度。本研究雖證實針刺對TBI早期起效，但最佳干預時機及其具體起效機制仍待進一步研究。

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Effects of Early Acupuncture on Serum GFAP and S-100B Protein in Rats with Traumatic Brain Injury

DU Ruosang，YUAN Hongwen，ZHENG Shumei，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective： To observe the effect of acupuncture on serum glial fibrillary acidic protein （GFAP） and S-100B protein in rats with traumatic brain injury （TBI），and to evaluate the therapeutic effect of acupuncture on traumatic brain injury.Methods： 120 male SD rats were randomly divided into 4 groups，40 rats in each group：the sham operation group，the model group and the acupuncture group.In the sham operation group，only the bone window was opened and the model was not prepared；the TBI model was prepared in the model group and the acupuncture group；the acupuncture group

acupuncture treatment once a day after molding.6 h，1 d，3 d and 5 d after operation were taken as four time points.10 rats were randomly selected from each group at one time point.The contents of serum GFAP，S-100B protein and mNSS were observed and detected.Results： Compared with the sham operation group，the serum GFAP and S-100B protein levels increased in the model group only after 6 h（P<0.01）.At 6h and 1d after injury，it was showed that the GFAP level in the acupuncture group was lower than that in the model group（P<0.05）.Data of 6 h，1 d and 3 d showed that the level of S-100B protein in the acupuncture group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）.The mNSS scores of the model group were higher than those of the sham operation group （P<0.01） and the score of the acupuncture group was significantly lower than that of the model group （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion： Early intervention with acupuncture can obviously relieve the brain damage in rats with TBI.

Traumatic brain injury；Acupuncture；GFAP；S-100B protein；mNSS score

R245.3

A

1004-745X（2017）09-1589-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.026

2017-05-26）

首都醫科大學科研基金項目（自然科學類）（17ZR26）

△通信作者（電子郵箱：drcuihai@163.com）