牦牛乳清中α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的熱聚合反應

王立楓，馬鶯，李琳，崔杰

（哈爾濱工業大學化工學院，哈爾濱150090）

牦牛乳清中α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的熱聚合反應

王立楓，馬鶯，李琳，崔杰

（哈爾濱工業大學化工學院，哈爾濱150090）

通過使用體積排阻色譜法檢測不同加熱溫度和不同加熱時間對牦牛乳清蛋白形態及質量分數變化的影響。當加熱溫度達到80～90℃溶液中蛋白發生了不同程度的聚合，蛋白聚合質量分數隨著加熱溫度及加熱時間的增長呈現上升趨勢，同時α-乳白蛋白與β-乳球蛋白含量明顯降低。當加熱溫度未達到80℃時，溶液中沒有蛋白聚合的產生。結果表明，當加熱溫度高于β-乳球蛋白的變性溫度會導致蛋白聚合的產生，同時表明β-乳球蛋白在蛋白聚合中起主導地位。

牦牛乳；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；熱誘導；蛋白聚合.

0 引 言

牦牛是我國特色資源，其生存環境有海拔高、晝夜溫差大牧草生長期短，大氣壓低含氧量少，無污染的環境等特點[1]。現今世界共有牦牛1 600萬頭，我國有1 500萬頭左右占有量達世界牦牛總數90%以上[2]。隨著牦牛數量逐漸增加，牦牛周邊經濟重要性僅在水牛和黃牛之后排第三位[3]。

相對于牦牛數量及牦牛奶產量逐漸增加，對牦牛乳乳清蛋白的基礎研究略顯不足。牦牛乳清蛋白是牛乳蛋白中的主要的組成部分其主要成分為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。乳清蛋白其特有性質如乳化性質及凝膠性質等重要功能特性在食品應用中起到重要作用[4]。本研究采用體積排阻色譜（SEC）研究α-乳白蛋白和β-乳球蛋白經不同加熱時間及加熱溫度后溶液中蛋白的聚合形態及含量。

1 實 驗

1.1 材料

本研究所用牦牛乳采自四川紅原縣牦牛乳樣品，采集的樣品加入質量分數為0.03%的疊氮化鈉并在-18℃冷凍，采集后迅速送回實驗室進行牦牛乳熱穩定性的研究。

1.2 儀器設備

Agilent 1100高效液相色譜儀，體積排阻色譜柱TSKG3000SWXL，液相色譜柱JupiterC4 column。超高速離心機，美國密理博Millipore超濾系統。

2 方法

2.1 牦牛乳清蛋白的制備

牦牛乳流水室溫解凍后3 000 g離心，離心溫度4℃離心時間30 min去除牦牛乳中的脂肪。再使用超高速離心機離心90 000 g，離心溫度4℃離心時間30 min后取其上清液得到牦牛乳乳清蛋白。將取得的牦牛乳清蛋白經超濾系統50 ku膜過濾取濾過液即為乳清中α-乳白蛋白與β-乳球蛋白。

2.2 牦牛乳清蛋白的熱處理

取3 mL牦牛乳清蛋白至于10 mL試管中，使用水浴鍋加熱至60，70，80，90 ℃；加熱時間為10，20，30 min；加熱后取出冷卻至室溫，以未加熱乳清蛋白對照。

2.3 使用液相色譜檢測分離乳清蛋白種類及質量分數

牦牛乳蛋白分析參考Li等人的方法[5]。選用Sig?ma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白質標準品。取1mL牦牛脫脂乳分散到4 mL緩沖液中（濃度為8 mol/L尿素，0.165 mol/L的Tris，濃度為0.044 mol/L檸檬酸鈉和體積分數為0.3%的二巰基乙醇）。RP-HPLC系統：Agilent1100。柱類型及規格：JupiterC4 column（250 mm× 4.6 mm，300Asizedpores，5 μm sized parti?cles）。檢測波長為220 nm，溫度為30℃，進樣量為20 μL，洗脫液流速為0.8 mL/min。洗脫液：A和B兩種洗脫液，A為色譜純的水（加質量分數為0.1%的三氟乙酸），B為色譜純的乙腈（加質量分數為0.1%的三氟乙酸）。洗脫條件為：上樣前先用A液平衡，上樣后0～40 min B液質量分數從30%升到50%；40～42min的B液質量分數從50%升到100%；42～43 min B液質量分數為100%；43～46 min B液濃度從100%降到30%，然后再用起始洗脫液洗脫5 min，總洗脫時間為51 min。用牦牛乳的HPLC圖譜對比對照分離出的乳清蛋白的純度及蛋白質量分數。

2.4 排阻色譜分析乳清聚合蛋白形態及質量分數

牦牛乳清蛋白分析參考Thomas[6]的試驗方法。選用Sigma公司的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白各50 mg，作為標準對照樣品對照牦牛乳清相應蛋白。將加熱后牦牛乳清蛋白樣品經0.45 μm濾膜過濾取濾過液。SEC-HPLC系統：Agilent 1100。柱類型及規格TSK G3000SWXL（300 mm×3.8 mm i.d.）。色譜柱與Agilent 1100高效液相色譜儀相連接，檢測波長280 nm，使用濃度為0.1 mol/L的Na2SO4，質量分數為0.05%的NaN3濃度0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.7），進樣量10 μL，流速1.0 mL/min。

3 結果與分析

3.1 液相色譜檢測分離的乳清蛋白

使用液相色譜檢測超速離心后經超濾系統處理后得到的乳清溶液，結果如圖1所示。得到的牦牛乳乳清溶液中，只含有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兩種乳清蛋白，并且沒有其他乳清蛋白以及酪蛋白存在。這是因為高速離心條件下可以使酪蛋白與乳清蛋白分離，經過50 ku超濾后可以使分子量大于50 000 u的乳清蛋白以及可溶于溶液中的少量酪蛋白與α-乳白蛋白及β-乳球蛋白分離。通過檢測數據計算得出溶液中牦牛乳清中α-乳白蛋白與β-乳球蛋白兩種蛋白質量分數的比例約為1∶5，其質量分數比例與牛乳相比略低，這是因為牦牛乳中α-乳白蛋白的質量分數自身較低[7]。

3.2 不同加熱溫度對蛋白聚合形態的影響

圖1 分離得到的牦牛乳清溶液

樣品于60～90℃水浴加熱，加熱10 min后與未加熱樣品對照，結果如圖2所示。圖2中，在未加熱的乳清中，溶液中沒有α-β二聚體和蛋白聚合體的形式存在。當加熱溫度增加至60℃和70℃，樣品中雖然有α-β二聚體生成，但沒有蛋白聚合體產生。當加熱溫度增加至80℃樣品中蛋白聚合產生其質量分數為16.95%，隨著加熱溫度增加至90℃蛋白聚合質量分數達到最高的51.70%。而同時α-β二聚體的質量分數則隨著溫度的升高呈現是先增加而后降低的趨勢。當加熱溫度增加至60℃時α-β二聚體產生，加熱溫度達到70℃其質量分數增加至最高的1.63%，之后質量分數則隨加熱溫度增加質量分數呈下降趨勢，當加熱溫度增加至90℃其質量分數降低至1.23%。同時β-乳球蛋白的四倍體、雙倍體以及其單體形態，α-乳白蛋白的質量分數都是隨溫度的增加而呈現逐漸降低的趨勢。相對未加熱樣品，其占蛋白質量分數比例分別降20.37%，2.18%，21.33%以及8.85%。在加熱溫度不高于70℃時，蛋白質量分數變化并不明顯，當加熱溫度增加至80℃溶液中各蛋白質量分數比例變化有明顯增加至18%，在90℃時蛋白質量分數變化明顯，其中蛋白聚合質量分數高于50%，同時α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質量分數分別降低至35%和10%。

加熱至60℃，α-β二聚體出現是因在60℃時牦牛α-乳白蛋白發生變性，因此與β-乳球蛋白形成了少量的α-β二聚體。并在70℃條件下質量分數增加，當加熱溫度增至80℃溶液蛋白聚合產生，是因為β-乳球蛋白的變性溫度在80℃左右[8]，因此80℃條件下變性的乳清蛋白形成了蛋白聚合，其蛋白質量分數約占18%，隨著變性溫度增加至90℃，加熱溫度明顯高于β-乳球蛋白變性溫度，乳清蛋白變性質量分數有顯著增加，蛋白聚合增幅明顯達到23.8%，同時其他蛋白質量分數明顯降低。由于蛋白產生聚合因此溶液中各種蛋白形態的質量分數都有明顯的降低，α-乳白蛋白在加熱后與β-乳球蛋白產生蛋白聚合，但在加熱至80℃條件下蛋白質量分數降低不明顯，當加熱至90℃蛋白聚合質量分數有顯著增加，同時α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質量分數也隨之明顯降低。

加熱可以導致乳清蛋白游離的巰基活性增加，進而導致蛋白中巰基與二硫鍵產生交換重組，促使蛋白產生聚合。α-乳白蛋白中沒有游離的巰基，而β-乳球蛋白中含有游離的巰基，所以β-乳球蛋白在蛋白聚合中起到了決定作用，因此當加熱溫度達到80℃有蛋白聚合的產生[9]。

3.3 加熱時間對蛋白聚合及質量分數的影響

在加熱至60℃與70℃條件下，雖然α-乳白蛋白發生變性，但β-乳球蛋白沒發生變性，因此其在蛋白聚合中并不起到主要作用，也表明β-乳球蛋白在蛋白聚合中起到主要作用[10]。由圖2可以看出，在加熱至60℃以及70℃加熱對蛋白質量分數沒有明顯影響，因此后續實驗主要針對加熱至80℃與90℃進行研究。相同加熱溫度的條件下，分別對乳清蛋白加熱10，20及30 min結果如圖3所示。

圖2 不同加熱溫度加熱10 min蛋白種類及質量分數的變化

當溫度增加至80℃蛋白質量分數隨加熱時間增加有不同程度的增加。在80℃加熱10，20，30 min后蛋白的聚合體質量分數分別為9.2%，12.7%，14.4%。表明在加熱80℃蛋白聚合質量分數隨加熱時間延長而明顯增加。同時乳清中其余蛋白形態質量分數都有不同程度的降低，其中β-乳球蛋白的減少尤為明顯，表明加熱溫度達到β-乳球蛋白變性溫度時，β-乳球蛋白的蛋白變性質量分數隨加熱時間的增加有明顯增加。同時α-乳白蛋白的質量分數有少量降低，說明α-乳白蛋白在80℃只有少量參與蛋白聚合中。

圖3 不同加熱溫度及時間質量分數的變化

當加熱溫度增加至90℃蛋白聚合質量分數在加熱10，20及30min后分別為23.1%，26.7%及30.0%。乳清溶液中各種蛋白形態的質量分數都有明顯的降低，說明加熱至90℃由于加熱溫度明顯高出β-乳球蛋白的變性溫度，進而使得大量的乳清蛋白變性導致蛋白聚合產生，蛋白聚合雖然隨加熱時間的增加而呈現上升趨勢，但質量分數增幅不明顯。表明當加熱溫度明顯高于β-乳球蛋白變性溫度的條件下，乳清中蛋白聚合的質量分數會有顯著的增長，同時在高溫加熱條件下，加熱時間的延長雖然可以使得蛋白聚合質量分數增加但相對加熱溫度對蛋白聚合影響甚微。

4 結論

（1）牦牛乳清蛋白溶液加熱聚合的過程中β-乳球蛋白與α-乳白蛋白都參與了蛋白聚合的過程。α-乳白蛋白在蛋白聚合的加熱過程中參與的質量分數與β-乳球蛋白相比有明顯偏低。加熱溫度低于80℃在溶液中沒有蛋白聚合的產生，表明在β-乳球蛋白在加熱變性之后溶液有蛋白聚合出現，也表明了在牦牛乳中β-乳球蛋白在蛋白聚合的過程中起主導地位。

（2）當加熱溫度高于80℃時，牦牛乳乳清蛋白聚合的產生隨著加熱溫度以及加熱時間的增加而呈現上升趨勢，當加熱至90℃乳清溶液中蛋白聚合有顯著增長其聚合質量分數超過20%。此時加熱時間的延長只會使得蛋白聚合有少量的增加。因此在蛋白加熱聚合的過程中加熱溫度在蛋白聚合中占據主導地位。

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Aggregation reaction of heat-induced yakα-Lactalbumin andβ-Lactoglobulin

WANG Lifeng，MA Ying，LI Ling，CUI Jie

（Chemical Engineering and Technology，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

Effect of yak whey proteins content and formations at different heat-treatment temperature（60～90 ℃）and heat-treatment time（10～30 min）were analyzed by SEC-HPLC.Protein aggregation was appeared at heating temperature 80 and 90 ℃ but the content was sig?nificant difference.The content of protein aggregation was increased with heating temperature and heat-treatment time increase，meanwhile the content ofα-Lactalbumin andβ-Lactoglobulin was decreased markedly.Aggregation was not appeared at heating temperature below 80℃ because aggregation was formed at heating temperature aboveβ-Lactoglobulin denaturation temperature.The results indicate that β-Lactoglobulin play dominant role in whey protein aggregation.

yak milk；α-Lactalbumin；β-Lactoglobulin；heat treatment；protein aggregation

Q936

A

1001-2230（2017）08-0011-03

2016-09-13

王立楓（1983-），男，博士，從事牦牛乳加熱聚合機制的研究。

馬鶯