結核感染T細胞斑點試驗聯合腺苷脫氨酶檢測診斷結核性胸膜炎的價值

吳景秋 房宏霞 蔚鳴 許鑫鑫 岳治國 劉玉琴 侯艷杰

·論著·

結核感染T細胞斑點試驗聯合腺苷脫氨酶檢測診斷結核性胸膜炎的價值

吳景秋 房宏霞 蔚鳴 許鑫鑫 岳治國 劉玉琴 侯艷杰

目的分析結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)聯合腺苷脫氨酶(ADA)檢測診斷結核性胸膜炎的價值。方法對2015年1—12月黑龍江省傳染病防治院確診或臨床診斷為結核性胸膜炎的145例患者和非結核性胸膜炎的59例患者進行回顧性分析。204例患者均于治療前進行了胸腔積液T-SPOT.TB和ADA檢測及外周血T-SPOT.TB檢測；對患者胸腔積液T-SPOT.TB、胸腔積液ADA、外周血T-SPOT.TB單獨檢測，以及胸腔積液T-SPOT.TB與胸腔積液ADA聯合檢測的結果進行比較。結果胸腔積液T-SPOT.TB診斷結核性胸膜炎的敏感度(98.62%，143/145)高于外周血T-SPOT.TB(88.97%，129/145)和胸腔積液ADA(87.59%，127/145)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=11.61，P<0.001；χ2=13.75，P<0.001)；胸腔積液ADA檢測的特異度(91.53%，54/59)均高于胸腔積液T-SPOT.TB(64.41%，38/59)和外周血T-SPOT.TB(61.02%，36/59)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=12.63，P<0.001；χ2=15.17，P<0.001)；將胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯合檢測和胸腔積液T-SPOT.TB單獨檢測進行比較，診斷結核性胸膜炎的敏感度由98.62%(143/145)降低至86.21%(125/145)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.94，P<0.001)，但特異度由64.41%(38/59)升高至100.00%(59/59)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.55，P<0.001)。結論胸腔積液T-SPOT.TB檢測結核性胸膜炎具有較高的敏感度和特異度，胸腔積液T-SPOT.TB和ADA聯合檢測可明顯提高診斷的特異度。

結核, 胸膜； 胸腔積液； 酶聯免疫斑點檢測； 腺苷脫氨酶； 診斷改善

資料和方法

一、研究對象和試劑來源

1. 研究對象：2015年1—12月期間，我院依據結核性胸膜炎診斷指南確診或臨床診斷為結核性胸膜炎的患者145例(結核組)、非結核性胸膜炎患者59例(對照組)。其中，男128例，女76例；年齡7～91歲，平均年齡(46.88±19.24)歲。分別收集入院治療前第一次抽取的外周血和胸腔積液進行T-SPOT.TB檢測，以及胸腔積液進行ADA檢測的結果，進行回顧性分析。

2. 結核性胸膜炎診斷分組及標準：(1)結核性胸膜炎：參照中華醫(yī)學會《臨床診療指南：結核病分冊》[8]中結核性胸膜炎的診斷指標：①胸腔積液涂片、培養(yǎng)或組織中查到結核分枝桿菌；②病理學檢查提示干酪性肉芽腫；③影像學表現符合結核性胸膜炎；④臨床特點符合結核性胸膜炎，結核菌素試驗陽性；⑤抗結核藥物治療2個月后，臨床表現和影像學表現有所好轉。符合①、②任意一項或③、④、⑤至少兩項可診斷為結核性胸膜炎。(2)非結核性胸膜炎；排除結核性胸膜炎的其他患者。

3. 主要試劑和儀器：T-SPOT.TB試劑盒(英國Immunotec公司)、人淋巴細胞分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司)、細胞培養(yǎng)液RPMI-1640(天津灝洋華科生物科技有限公司)、MD AIM-V細胞培養(yǎng)基(天津灝洋華科生物科技有限公司)、TL-5000CR臺式大容量冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、HF151UV CO2培養(yǎng)箱(上海力康醫(yī)療設備有限公司)、腺苷脫氨酶試劑盒(浙江伊利康生物技術有限公司)、西門子Dimension?RxL MAX?全自動生化分析儀。

二、實驗方法

1. 外周血樣本處理：采用T-SPOT.TB試劑盒，檢測分泌γ-干擾素(IFN-γ)的T細胞，嚴格按照試劑說明書操作，常規(guī)分離外周血單個核細胞，用細胞培養(yǎng)基MD AIM-V將細胞懸起，計數后細胞濃度調至2.5×106個/ml。

2. 胸腔積液樣本處理：(1)非血性胸腔積液40～50 ml，加0.2 ml(1250 U)肝素抗凝；(2)富集T淋巴細胞并用1640培養(yǎng)液調至7 ml，洗滌后將計數后的細胞濃度調至1.0×106個/ml。

4.利用信息技術，提高教師自身素質。要熟練的的運用多媒體技術，對教師本身也是一個挑戰(zhàn)，因為多媒體信息技術的運用需要我們熟練地掌握電腦知識。我們應該在平時的工作中不斷的學習、積累。并且將運用現代信息技術的能力作為提升自身業(yè)務素質的一項重要內容。在掌握計算機基本操作技能的同時,還要掌握多媒體課件的制作,以便作出適合英語學科特點的課件。

3. 胸腔積液及外周血T-SPOT.TB樣本測定：在預先包被有抗IFN-γ單抗的孔中加入0.1 ml的細胞懸液，每份樣品設置4個檢測孔，分別為陰性對照(無血清培養(yǎng)基)、陽性對照(植物血凝素)、抗原A[主要成分為早期分泌抗原靶6(ESAT-6)]、抗原B[主要成分為培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)]，各50 μl，樣品加好后放入HF151UV CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h，洗板，加顯色液、終止液，判讀結果。

4. T-SPOT.TB陽性結果判定標準：(1)空白對照孔斑點數為0～5個時，且(抗原A或抗原B孔的斑點數)-(空白對照孔斑點數)≥6；(2)空白對照孔斑點數為6～10個且(抗原A或抗原B孔的斑點數)≥2×(空白對照孔斑點數)。如果上述標準不符合且陽性質控對照孔正常時，結果為“陰性”。

5. ADA測定：應用10 ml抗凝玻璃管收集胸腔積液10 ml，1000×g離心5 min取上清液[9]；采用連續(xù)監(jiān)測法測定ADA的活性，嚴格按照試劑說明書進行操作，ADA值>40 U/L判定為陽性[3,10]。

三、統(tǒng)計學分析

采用Excel表建立數據庫，由專人對數據進行提取并轉入數據庫。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對原始數據進行統(tǒng)計分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、3種方法檢測情況的比較

胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB、胸腔積液ADA的檢測結果具體見表1。145例確診或臨床診斷為結核性胸膜炎的患者中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測陽性143例，外周血T-SPOT.TB檢測陽性129例，胸腔積液ADA檢測陽性127例；59例非結核性胸膜炎患者中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測陰性38例，外周血T-SPOT.TB檢測陰性36例，胸腔積液ADA檢測陰性54例；3種診斷結果分別與臨床診斷進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義。

二、3種方法單獨檢測和胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯合檢測的比較

1. 單獨檢測的診斷效能分析：胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度(98.62%)明顯高于外周血T-SPOT.TB檢測的敏感度(88.97%)和胸腔積液ADA檢測的敏感度(87.59%)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為11.61、13.75，P值均<0.001)；胸腔積液ADA檢測的特異度(91.53%)明顯高于胸腔積液T-SPOT.TB檢測的特異度(64.41%)和外周血T-SPOT.TB檢測的特異度(61.02%)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為12.63、15.17，P值均<0.001)(表2)。

2. 聯合檢測的診斷效能分析：將胸腔積液T-SPOT.TB和ADA檢測均為陽性定義為陽性，將其中1項檢測為陰性或兩種檢測均為陰性定義為陰性。胸腔積液T-SPOT.TB與胸腔積液ADA聯合檢測診斷結核性胸膜炎的敏感度為86.21%，低于胸腔積液T-SPOT.TB單獨檢測的敏感度(98.62%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.94，P<0.001)，但特異度由T-SPOT.TB單獨檢測的64.41%提高至100.00%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.55，P<0.001)，陽性預測值達到100.00%，總符合率達到90.20%(表2)。

三、受試者工作特征曲線分析

采用受試者工作特征曲線(簡稱“ROC曲線”)分析診斷結核性胸膜炎的最佳界值[11]，胸腔積液T-SPOT.TB檢測的ROC曲線下面積為0.93，外周血T-SPOT.TB檢測的ROC曲線下面積為0.86，前者診斷效能優(yōu)于后者；胸腔積液ADA檢測的ROC曲線下面積為0.95，具體見圖1。目前，T-SPOT.TB關于胸腔積液的檢測還沒有明確的界值，臨床研究多參考外周血界值≥6斑點形成細胞(SFCs)/2.5×105外周血單個核細胞(PBMCs)為標準進行結果判斷；本研究通過繪制ROC曲線得出：胸腔積液T-SPOT.TB在面積最大時ROC曲線拐點值為72 SFCs/2.5×105PBMCs，以此為界值，診斷結核性胸膜炎的敏感度為94.48%(137/145)，與既往采用的界值[(抗原A或抗原B孔的斑點數)-(空白對照孔斑點數)≥6(即6 SFCs/2.5×105PBMCs)；敏感度為98.62%(143/145)]比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.73，P=0.054)，但特異度分別為88.14%(52/59)和64.41%(38/59)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.18，P<0.001)，總符合率為92.65%(189/204)。此外，當胸腔積液ADA以36 U/L為界值時，診斷結核性胸膜炎的敏感度和特異度分別為92.41%(134/145)和89.83%(53/59)。

表1 3種方法對兩組患者進行檢測的結果比較

注a：3種診斷結果分別與臨床診斷進行比較的χ2值和P值

表2 3種方法單獨檢測和胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯合檢測的比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/(真陽性例數+假陽性例數+假陰性例數+真陰性例數)×100%

圖1 胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB和胸腔積液 ADA檢測的ROC曲線

討 論

一、胸腔積液T-SPOT.TB輔助診斷結核性胸膜炎的價值

T-SPOT.TB采用酶聯免疫斑點技術，測定在結核分枝桿菌特異性抗原刺激下受試者外周血樣本中釋放IFN-γ的效應T淋巴細胞數量，該方法在結核感染診斷中的價值已被越來越多的臨床研究證實，敏感度可高達90%左右[12-14]。但由于外周血T-SPOT.TB檢測不能區(qū)分結核分枝桿菌潛伏感染和活動性結核病，致使該檢測方法診斷活動性結核病的特異度受到限制[15-17]。結核性胸膜炎患者常常伴有胸腔積液，發(fā)病期間結核分枝桿菌感染局部的隔室化效應致使血液中大量效應T淋巴細胞進入胸腔積液發(fā)揮免疫學效應，因此檢測胸腔積液中結核抗原特異性T淋巴細胞數量可能受到結核分枝桿菌潛伏感染的影響較小，更適用于結核性胸膜炎的輔助診斷[18-19]。劉曉清[20]比較了胸腔積液T-SPOT.TB和外周血T-SPOT.TB兩種檢測方法對結核性胸膜炎的診斷價值，提示胸腔積液結核特異性T淋巴細胞計數是外周血的4.6倍，支持了結核性胸膜炎發(fā)生時結核特異性T淋巴細胞從外周血向胸膜腔遷移的理論[21]。本研究中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測較外周血T-SPOT.TB的敏感度(98.62%與88.97%)、特異度(64.41%與61.02%)均高，可見胸腔積液T-SPOT.TB檢測是結核性胸膜炎較好的實驗室診斷手段。

二、胸腔積液ADA輔助診斷結核性胸膜炎的價值

ADA主要由T淋巴細胞產生，是一種廣泛分布在人體組織和體液中的酶，其活性與淋巴細胞的激活和分化有關[22-23]，機體受到結核分枝桿菌感染后，主要以細胞免疫為主，而ADA活性是反映細胞免疫功能的重要指標，結核性胸膜炎患者因細胞受到刺激，胸腔積液中淋巴細胞明顯增多。因此，ADA水平升高在除外淋巴瘤后可基本確認為結核感染[4,22]。本研究中，胸腔積液ADA檢測的敏感度為87.59%，而特異度高達91.53%，胸腔積液ADA用于結核性胸膜炎的診斷具有重要價值，能夠明顯提高診斷的特異度。但該方法對于炎癥早期或者機體免疫功能減退的患者，如HIV感染并發(fā)結核病患者可能存在假陰性；在肺炎旁積液和類風濕病中可能存在假陽性[24]。

三、胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯合診斷結核性胸膜炎的價值

胸腔積液T-SPOT.TB單獨檢測用于鑒別診斷結核性胸膜炎具有非常好的敏感度(98.62%)，特異度為64.41%；胸腔積液ADA單獨檢測用于鑒別診斷結核性胸膜炎的敏感度為87.59%，特異度為91.53%，而兩者聯合檢測可以明顯提高結核性胸膜炎診斷的特異度。本研究顯示，胸腔積液T-SPOT.TB聯合ADA檢測的敏感度為86.21%，特異度達到100.00%，陽性預測值高達100.00%。當胸腔積液T-SPOT.TB取72 SFCs/2.5×105PBMC為界值時，總體符合率最高，達到92.65%。

但是本研究仍存在以下不足：首先，大多數結核性胸膜炎患者難以獲得結核分枝桿菌病原學陽性結果，診斷多依據臨床表現、影像學表現及常規(guī)生化指標，盡管符合臨床實際，但可能對T-SPOT.TB及ADA檢測診斷性能的評估出現偏差；其次，與結核性胸膜炎入組患者例數(145例)相比，非結核性胸膜炎入組例數(59例)相對較少，有關特異度的數據還需進一步驗證。再次，應用T-SPOT.TB試劑盒進行胸腔積液樣本檢測還沒有明確的界值，本研究取72 SFCs/2.5×105PBMCs為界值能否作為臨床診斷結核性胸膜炎的參考依據，還需要大樣本多中心的研究。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測快速方便，有非常高的敏感度，胸腔積液ADA檢測有較高的特異度，兩種方法聯合檢測可明顯提高診斷的特異度和總體符合率，對于結核性胸膜炎的診斷具有較高的應用價值和廣闊的應用前景。

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(本文編輯：郭萌)

ThediagnosticvalueofMycobacteriumtuberculosisTcellenzyme-linkedimmunospottuberculoustest(T-SPOT.TB)combinedwithadenosinedeaminase(ADA)inpatientswithpleuraltuberculosis

WUJing-qiu*,FANGHong-xia,WEIMing,XUXin-xin,YUEZhi-guo,LIUYu-qin,HOUYan-jie.

*InfectiousDiseaseHospitalofHeilongjiangProvince,Harbin150500,China

Correspondingauthor:HOUYan-jie,Email:houyanjie2776@163.com

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of theMycobacteriumtuberculosisT cell enzyme-linked immunospot test for tuberculosis (T-SPOT.TB) and adenosine deaminase (ADA) testing in patients with pleural tuberculosis.MethodsOne hundred and forty-five patients with confirmed or clinically diagnosed pleural tuberculosis and 59 patients with non-pleural tuberculosis were enrolled in this study from January 2015 to December 2015; all diagnoses were retrospectively analyzed. Pleural effusions and peripheral blood samples were collected from all 204 patients in the study before the onset of treatment and subsequently tested using T-SPOT.TB. ADA levels in pleural effusions were also measured. Pleural effusion T-SPOT.TB results, pleural effusion ADA levels and peri-pheral blood T-SPOT.TB results were compared separately, and against a combination of pleural effusion T-SPOT.TB and ADA levels.ResultsThe sensitivity of pleural effusion T-SPOT.TB (98.62%, 143/145) was significantly higher than that for peripheral blood T-SPOT.TB (88.97%, 129/145) and pleural effusion ADA (87.59%, 127/145) (χ2=11.61，P<0.001；χ2=13.75，P<0.001). The specificity of pleural effusion ADA (91.53%, 54/59) was significantly higher than that of pleural effusion T-SPOT.TB (64.41%, 38/59) and peripheral blood T-SPOT.TB (61.02%, 36/59), (χ2=12.63，P<0.001；χ2=15.17，P<0.001). Combining detection of pleural effusion T-SPOT.TB and ADA levels reduced the sensitivity from 98.62% (143/145) to 86.21% (125/145), compared with pleural effusion T-SPOT.TB (χ2=15.94，P<0.001), but increased specificity from 64.41% (38/59) to 100.00% (59/59) (χ2=25.55，P<0.001).ConclusionPleural effusion T-SPOT.TB is a highly sensitive and specific method for the detection of pleural tuberculosis. Combining pleural effusion T-SPOT.TB results with ADA testing can significantly improve diagnostic specificity.

Tuberculosis, pleural; Pleural effusion; Enzyme-linked immunospot assay; Adenosine dea-minase; Quality improvement

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.10.012

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院(吳景秋、蔚鳴、許鑫鑫、岳治國、劉玉琴、侯艷杰)；深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心(房宏霞)

侯艷杰，Email：houyanjie2776@163.com

2017-06-13)