集落刺激因子1受體對促進鼻咽癌6-10B細胞cyclin D1表達及其增殖能力的影響

徐細明，陳嘉羽,，蒿艷蓉，陳甲信，黃俐，敖雯，李雷，成俊萍，陳釗宏，梁務清，郝鑫，高偉偉

(1武漢大學人民醫院，武漢430060；2廣西壯族自治區人民醫院)

集落刺激因子1受體對促進鼻咽癌6-10B細胞cyclin D1表達及其增殖能力的影響

徐細明1，陳嘉羽1,2，蒿艷蓉2，陳甲信2，黃俐1，敖雯2，李雷2，成俊萍2，陳釗宏2，梁務清2，郝鑫2，高偉偉2

(1武漢大學人民醫院，武漢430060；2廣西壯族自治區人民醫院)

目的探討集落刺激因子1受體(CSF-1R)對人鼻咽癌6-10B細胞細胞周期素(cyclin)D1表達及其增殖的影響。方法選取人鼻咽癌6-10B細胞，體外利用慢病毒構建的CSF-1R過表達載體LV-CSF1R(16957-1)轉染到人鼻咽癌 6-10B細胞中(轉染組)，未轉染CSF-1R慢病毒載體的鼻咽癌6-10B細胞為對照組。采用RT-qPCR法及Western blotting法檢測轉染組及對照組細胞CSF-1R、cyclin D1的表達情況，CCK-8 法檢測各組細胞活力的改變情況。結果轉染組細胞CSF-1R mRNA 及其蛋白表達水平明顯高于對照組(P均<0.05)。轉染組鼻咽癌6-10B細胞活力較對照組明顯增高(P<0.05)。結論過表達CSF-1R 可以通過調節細胞周期蛋白cyclin D1來促進鼻咽癌6-10B細胞的惡性生長。

鼻咽腫瘤；集落刺激因子1受體；受體酪氨酸激酶家族；細胞周期素

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of colony stimulating factor-1 receptor (CSF-1R) on cyclin D1 expression and cell proliferation of human nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells.MethodsThe human nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells were transfected with CSF-1R lentiviral vector LV-CSF1R (16957-1) (transfection group), and the 6-10B cells without transfection of CSF-1R lentiviral vector were taken as the control group. The expression of CSF-1R and cyclin D1 was detected by RT-qPCR PCR and Western blotting. CCK-8 assay were used to detect the cell activity in each group.ResultsThe expression of CSF-1R at mRNA and protein levels increased significantly in the transfection group as compared with that of the control group (P<0.05). The activity of 6-10B cells was significantly higher in the transfection group than that of the control group (P<0.05).ConclusionOver-expression of CSF-1R significantly promotes the malignant growth of nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells by regulating the expression of cyclin D1.

Keywords: nasopharyngeal carcinoma; colony stimulating factor-1 receptor; receptor tyrosine kinases; cyclin D1

集落刺激因子1及其受體(CSF-1/CSF-1R)在腫瘤進展中發揮著重要的作用，CSF-1和CSF-1R的擴增會導致細胞增殖[1]。CSF-1R是受體酪氨酸激酶家族成員之一，在多種人類惡性組織和細胞株中高表達[2～5]。因此在某些惡性腫瘤中，循環血液中的CSF-1R被定義為腫瘤標志物。放射治療是鼻咽癌主要的治療方式，但放療抵抗是其局部復發和遠處轉移的根源[6]。另有研究顯示，惡性腫瘤是多基因表達異常導致的細胞周期失控性疾病。細胞周期調控由諸多因子共同完成，其中主要因子是細胞周期素 (cyclin)[7]，其表達異常是惡性腫瘤中細胞周期表達失調的主要原因[8]。 2017年1～4月，我們通過CSF-1R慢病毒載體轉染鼻咽癌6-10B細胞，觀察轉染后細胞CSF-1R、cyclin D1表達及細胞增殖活力的變化，為鼻咽癌提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 鼻咽癌6-10B細胞培養 鼻咽癌6-10B細胞株購于APTT細胞庫。培養液由RPMI-1640加10%胎牛血清混合而成。培養液每2 d更換1次，細胞在含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中進行培養。

1.2 鼻咽癌6-10B細胞CSF-1R過表達載體轉染 CSF-1R慢病毒載體由上海吉凱基因有限公司構建，病毒攜帶增強型綠色熒光蛋白(eGFP)。磷酸平衡鹽溶液用于稀釋病毒并分裝，分裝病毒液濃度為5×108TU/mL。吉凱基因慢病毒載體系統由 GV 慢病毒載體系列、pHelper 1.0 載體和 pHelper 2.0 載體三質粒組成。已知6-10B細胞病毒感染的MOI=100，并將病毒液稀釋至濃度為1×108TU/mL備用。根據吉凱基因慢病毒使用手冊說明提供的資料進行轉染。用完全培養基制備密度為4×104/mL的細胞懸液，取2 mL接種至6孔板中，培養24 h時后更換培養基。向6孔板中加入800 μL新鮮培養基與濃度為1×108TU/mL病毒液200 μL混勻后感染12 h，換回常規培養基繼續培養48 h。于感染72 h后利用熒光顯微鏡檢測eGFP的表達量判定轉染效率，轉染效率在80%左右時說明6-10B細胞CSF-1R慢病毒載體轉染成功，作為轉染組進行下一步實驗。未轉染CSF-1R慢病毒載體的鼻咽癌6-10B細胞為對照組。

1.3 鼻咽癌6-10B細胞CSF-1R、cyclin D1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR檢測。兩組細胞經6孔板培養48 h后，胰蛋白酶處理制成細胞懸液，用細胞計數板計數細胞后，取含有2×106個細胞的細胞懸液轉移至RNase-Free的離心管中，離心收集細胞沉淀，加入Trizol試劑提取細胞總 RNA，紫外分光度計下測A260/A280比值處于1.8～2.1的RNA即符合純度要求。取 1 μg總RNA 進行逆轉錄反應，按照FastQuant RT試劑盒(TIANGEN,Beijing,China)說明書合成 cDNA，引物由Primer5.0引物設計軟件設計，并由Life Technologies公司合成。Real-time PCR 反應體系25 μL：2 uL cDNA、12.5 μL 2× SYBRPremix Ex Taq TM Ⅱ(TliRNaseH Plus)、8.5 μL 雙蒸水、每對引物(10 μmol/L)1.0 μL。每個樣本設 3 個復孔。反應條件如下: 95 ℃預變性 15 min 后，完成 40 個循環(95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s)。CSF-1R、cyclin D1 mRNA的相對表達水平由2-ΔΔ Ct公式進行計算，即Δ Ct=Ct (target gene)-Ct(GAPDH)，GAPDH 選作內參。

1.4 鼻咽癌6-10B細胞CSF-1R、cyclin D1 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑cocktail按100∶1進行混合用于提取轉染組和對照組細胞的總蛋白，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 g離心20 min收集上清液。蛋白濃度由Bicinchoninic Acid 測試盒進行測定。每個泳道加入等質量蛋白樣本，以初始電壓80 V進行穩壓電泳，待所有蛋白進入分離膠且彩虹Marker各條帶分開之后，調整電壓為120 V繼續電泳，直至蛋白距膠下緣1 cm左右時結束電泳。電泳結束后以250 mA的恒流進行轉膜約1.5 h。PVDF膜浸泡于5% BSA封閉液中，且保證正面接觸封閉液，置于搖床上室溫(26 ℃)緩慢搖晃1.5 h。將膜按照不同蛋白裁剪至合適大小，做好標記，正面接觸一抗，浸泡于對應的稀釋好的一抗[CSF 1R單克隆兔抗(1∶1 000，ab210556)、cyclinD1單克隆兔抗 (1∶1 000，ab134175，)、GAPDH單克隆兔抗(1∶1 000，ab181602) ]中4 ℃過夜。第2天將PVDF膜浸泡于對應的稀釋好的二抗(山羊抗兔IgG二抗稀釋濃度為1∶5 000)中37 ℃孵育1.5 h。最后將ECL發光系統A、B發光液按1∶1的比例混合，并將PVDF膜覆于混合液上反應1 min，進行顯影。

1.5 鼻咽癌6-10B細胞增殖活力檢測 采用CCK-8 法。細胞消化重懸，制備成細胞懸液，計數細胞。稀釋細胞懸液接種到96孔板3 000個/孔，每孔細胞懸液體積為100 μL，每個樣本做5個副孔。設定轉染組、未轉染組、空白對照，空白對照孔中加入無細胞的完全培養基。37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。次日按時間點在超凈臺中避光加入CCK-8，每孔10 μL，加好后輕輕敲擊培養板以幫助混勻，繼續放入恒溫孵育箱培養，分別測定培養24、48、72 h時 450 nm 波長下每孔的吸光度值。吸光度值越大，表明細胞數越多。

2 結果

2.1 轉染組及對照組細胞CSF-1R、cyclin D1 mRNA表達 鼻咽癌6-10B細胞株轉染攜帶有CSF-1R的慢病毒載體，熒光顯微鏡觀察顯示轉染效率約90%,見圖1。轉染組及對照組細胞CSF-1R mRNA相對表達量分別7.01±0.23、0.09±0.03(P<0.05)，cyclin D1 mRNA相對表達量分別分別15.53±0.77、1.00±0.074(P<0.05)。鼻咽癌6-10B細胞轉染CSF-1R的慢病毒載體后CSF-1R 、cyclin D1 mRNA表達量明顯上調。

注：A為對照組，B為轉染組；白色斑點為CSF-1R慢病毒載體。

圖1熒光顯微鏡下CSF-1R轉染效率顯示圖

2.2 轉染組及對照組細胞CSF-1R、cyclin D1 蛋白表達 轉染組與對照組比較，CSF-1R及cyclin D1蛋白表達水平均上升(P均<0.05)。見圖2。

圖2 轉染組及對照組細胞CSF-1R、cyclin D1蛋白表達電泳圖

2.3 轉染組及對照組不同培養時間細胞增殖活力變化 轉染組吸光度值較對照組大，表明細胞數多，細胞增殖活力強，CSF-1R的過表達促進鼻咽癌6-10B細胞的生長。見表1。

表1 兩組不同培養時間細胞增殖活力比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

CSF-1R是一種由972個氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體[9]。它是由巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞和腫瘤細胞所產生，能調節巨噬細胞的形態和運動、促進單核吞噬細胞的增殖和分化，而且還是炎癥病灶的趨化因子，在免疫應答中發揮重要作用。

細胞周期分為 G1、S、G2和M期，其代表性標記物有cyclin D(G1期)、cyclin E(S期)、胞質 cyclin A(G2期)以及 cyclin B1(M期)。細胞周期中存在兩個檢測點 G1/S和G2/M，體內外因素可通過這兩個檢測點引起細胞周期受阻。cyclin D 包括3個亞型：D1、D2、D3，其中 cyclin D1 的過度表達可使細胞失去對生長因子的依賴，使G1/S調控點失控，細胞不停地進入細胞增值周期，造成惡性增生而發生癌變[10]。趙曉榮等[11]研究表明，cyclin D1 是鼻咽癌細胞周期中必不可少的調節因子。李建萍等[12]報道 cyclin D1 蛋白表達與鼻咽部上皮細胞惡性增生密切相關，吳進盛[13]研究表明， cyclin D1 的表達程度與鼻咽癌放射治療療效之間具有明顯的負相關，丁絲露等[14]研究表明，cyclin D1 的表達程度與鼻咽癌的預后密切相關，cyclin D1高表達的患者預后更差。本研究發現cyclinD1的表達量在CSF-1R過表達組中顯著增加，這表明CSF-1R可能通過cyclin D1影響G1/S細胞周期，使鼻咽癌細胞的細胞周期失調，從而促進腫瘤細胞的增殖。

雖然放射治療在鼻咽癌治療中取得了巨大成就，但30%～60%的患者仍會出現轉移，主要原因是部分患者產生了放療抵抗。因此，本實驗著手研究CSF-1R對鼻咽癌細胞發生發展中的作用以及其可能分子機制。我們通過分析篩選出鼻咽癌細胞增殖可能的信號通路，發現cyclin D1可能是其下游的信號分子，通過影響細胞周期，介導鼻咽癌細胞的惡性增殖。通過慢病毒轉染技術上調6-10B細胞株中CSF-1R的表達量并檢測轉染效率，利用RT-qPCR、Western blotting分別檢測cyclin D1、CSF-1R mRNA及其蛋白表達量。結果顯示cyclin D1、CSF-1R mRNA及其蛋白表達在CSF-1R過表達組中顯著升高，CSF-1R過表達使鼻咽癌6-10B細胞株增殖性增高。這些結果表明CSF-1R可能通過cyclin D1 的過度表達使G1/S調控點失控，進而促進鼻咽癌6-10B細胞的生長。

綜上所述，CSF-1R通過cyclin D1介導鼻咽癌細胞的增殖，其可能的機制是CSF-1R通過PI3K-AKT 信號通路影響細胞周期。這些發現為揭示鼻咽癌發生發展的分子機制提供幫助，并為研制鼻咽癌新型分子靶向藥物、攻克放療抵抗這一難題提供參考依據。

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Effects of CSF-1R on cyclin D1 expression and cell proliferation of human nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells

XUXiming1,CHENJiayu,HAOYanrong,CHENJiaxin,HUANGLi,AOWen,LILei,CHENGJunping,CHENZhaohong,LIANGWuqing,HAOXin,GAOWeiwei

(1RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhuan430060,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.006

R766.3

A

1002-266X(2017)33-0020-04

國家自然科學基金資助項目(81260348)；廣西醫療衛生重點科研課題(2010037 )。

徐細明(1977-)，男，主任醫師，博士，碩士生導師，主要從事消化道腫瘤臨床及基礎的研究。E-mail: whuxxm@yahoo.com

蒿艷蓉(1967-)，女，主任醫師，博士，碩士生導師，主要從事惡性腫瘤臨床及基礎研究工作。E-mail：282174944@qq.com

2017-05-31)