miR-199a-3p在食管鱗癌細胞中的表達及其對細胞增殖和凋亡的影響*

高 盼，魯照明，劉襄艷，張幸麗，凡 丞，師瑩瑩，侯桂琴

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

miR-199a-3p在食管鱗癌細胞中的表達及其對細胞增殖和凋亡的影響*

高 盼，魯照明，劉襄艷，張幸麗，凡 丞，師瑩瑩，侯桂琴#

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

miR-199a-3p；食管鱗癌；細胞增殖；細胞凋亡

目的：探討miR-199a-3p在食管鱗癌細胞中的表達情況及其對細胞增殖、凋亡的影響。方法采用Real-time PCR法檢測miR-199a-3p在5株食管鱗癌細胞TE1、Eca109、EC9706、KYSE450、KYSE790中的表達。用siRNA-MateTM轉染試劑將人工合成的miR-199a-3p模擬物 mimics轉染Eca109、EC9706細胞后，采用Real-time PCR法檢測miR-199a-3p的表達，采用克隆形成實驗、CCK-8法及雙染法檢測細胞克隆形成能力、增殖能力和凋亡率，Western blot檢測mTOR、p-p70S6K和Bcl-2蛋白的表達。以未轉染細胞為空白對照，以轉染mimics陰性對照的細胞為陰性對照。結果miR-199a-3p在5株食管鱗癌細胞中均有表達，表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照組和陰性對照組細胞相比，轉染mimics的Eca109和EC9706細胞中miR-199a-3p相對表達量顯著升高(P<0.001)，細胞克隆形成能力降低(P<0.001)，細胞增殖能力降低(P<0.001)，細胞凋亡率增加(P<0.001)，mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達水平降低。結論miR-199a-3p可能是通過調節mTORC1/p70S6K信號通路來抑制食管鱗癌細胞的增殖并促進細胞的凋亡。

食管癌是一種較常見的消化道惡性腫瘤，我國90%以上的食管癌患者其病理學類型為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內源性的非蛋白質編碼的小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的非編碼區域(3’-untranslated region，3’UTR)互補匹配，干擾mRNA分子的翻譯，從而下調靶基因的表達[2]。miR-199a-3p是miR-199a的一個亞基，能夠調控細胞增殖和凋亡。報道[3]證實，miR-199a可通過與MeCP2結合調節mTOR信號通路，影響RTT(Rett Syndrome Phenotypes)疾病的發展過程；通過抑制mTOR和c-Met的表達而提高肝癌細胞對多柔比星的敏感性[4]；也可通過靶向mTOR的3’UTR，抑制mTOR的表達，從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖[5]；還可通過抑制Met和mTOR的表達，抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的增殖和遷移[6]。作者觀察了miR-199a-3p對ESCC細胞增殖、凋亡及mTORC1/p70S6K信號通路相關蛋白表達的影響，探討ESCC發生發展確切的分子機制，為其分子靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑ESCC細胞TE1、Eca109、EC9706購自上海中科院細胞庫，KYSE450和KYSE790由鄭州大學第一附屬醫院李晟磊教授惠贈，其中TE1和EC9706是低分化細胞株，Eca109、KYSE450、KYSE790是高分化細胞株，5株細胞用含有體積分數10%胎牛血清的完全培養基于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。人工合成的miR-199a-3p模擬物 mimics、mimics陰性對照及siRNA-MateTM轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-199a-3p引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；反轉錄試劑盒和Real-time PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；GAPDH、mTOR、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、Bcl-2兔抗人多克隆抗體均購自美國CST公司；CCK-8試劑購自鄭州德雅科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術股份有限公司。

1.2 5株ESCC細胞中miR-199a-3p表達的檢測

分別收集對數生長期的5株細胞，提取總RNA并反轉錄得cDNA，用Real-time PCR法檢測miR-199a-3p。miR-199a-3p引物序列為：上游5’-GCCGAA CAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-TATGGTTTT GACGACTGTGTGAT-3’；U6內參引物序列為：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’；U6反轉錄引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR反應體系20 μL，其中cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR 10 μL，dH2O 6.4 μL。每個樣本設置3個復孔。反應程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s，62 ℃30 s，40個循環；95 ℃5 s，60 ℃60 s，95 ℃1 s；50 ℃30 s。記錄Ct值，按照2-ΔΔCt計算miR-199a-3p的相對表達量。

1.3轉染mimics的Eca109和EC9706細胞增殖、凋亡、miR-199a-3p及mTORC1/p70S6K信號通路相關蛋白表達的檢測

1.3.1 轉染 將適量Eca109和EC9706細胞接種于6孔板中，過夜培養至細胞融合度達30%～50%。分別取11 μL預先配制好的mimics及陰性對照加入到含有200 μL基礎培養基的無RNA酶EP管中，混勻，室溫孵育5 min，加入適量siRNA-MateTM，混勻，室溫孵育10 min，然后將配制好的轉染試劑加入細胞培養孔，使mimics及陰性對照終濃度為100 nmol/L。將6孔板放入培養箱中培養6 h后，更換成完全培養基繼續培養。以未轉染細胞作空白對照。

1.3.2 miR-199a-3p的檢測 更換成完全培養基繼續培養48 h后收集各組細胞并提取總RNA，按1.2方法測定miR-199a-3p的相對表達量。

1.3.3 細胞克隆形成實驗 轉染24 h后，將各組細胞接種于6孔板中，每孔1 000個，每組3個復孔，放入培養箱中培養，每隔3 d換一次培養基，當出現肉眼可見的細胞團時終止培養。棄去原培養基，用PBS洗2～3次，加1 mL甲醇固定30 min，棄去甲醇，再用PBS洗2～3次，加1 mL 10 g/L結晶紫染色30 min，最后用PBS沖洗直至細胞周圍無明顯紫色為止，室溫晾干，拍照，用Image J進行細胞克隆計數。

1.3.4 細胞增殖的檢測 采用CCK-8法檢測。將適量細胞接種至96孔板中，過夜培養至細胞融合度在30%～50%。第2天進行轉染，方法同1.3.1。轉染6、24、48、72和96 h后，加入CCK-8繼續培養4 h，最后測定450 nm處的吸光度值，表示細胞增殖能力。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.3.5 細胞凋亡的檢測 轉染48 h后收集各組細胞，用預冷PBS洗1～2次，加1 mL 1×Binding Buffer重懸，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用適量1×Binding Buffer重懸，再加5 μL Annexin V-FITC室溫孵育10 min，加5 μL PI室溫孵育5 min，然后上流式細胞儀檢測。整個操作過程應避光。實驗重復3次。

1.3.6 mTOR、p-p70S6K和Bcl-2蛋白檢測 轉染72 h后收集各組細胞，Western blot法檢測mTOR、 p-p70S6K和Bcl-2蛋白。蛋白上樣量均為20 μg，一抗稀釋比例均為11 000，二抗稀釋比例均為110 000。電泳條件為80 V 40 min，120 V 1 h。轉膜條件為300 mA 2 h。50 g/L脫脂奶粉PBST封閉2 h，4 ℃過夜。次日用PBST洗10 min×3次，室溫振搖2 h。然后PBST洗10 min×3次，ECL超敏發光液孵育1 min，曝光。實驗重復3次。

1.4統計學處理數據用SPSS 21.0進行統計分析，組間各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5株ESCC細胞中miR-199a-3p的表達Real-time PCR實驗結果顯示，TE1、Eca109、EC9706、KYSE450、KYSE790細胞中miR-199a-3p的相對表達量分別為(1.351±0.549)、(1.362±0.130)、(1.368±0.279)、(1.346±0.181)、(1.352±0.860)，5組比較差異無統計學意義(F=0.001，P>0.999)，提示miR-199a-3p的表達水平與ESCC細胞分化程度無關。

2.2轉染mimics的Eca109和EC9706細胞中miR-199a-3p的表達見表1。轉染mimics的Eca109和EC9706細胞中miR-199a-3p相對表達量較陰性對照和空白對照顯著升高(P<0.05)。

表1 轉染mimics的Eca109、EC9706細胞中miR-199a-3p的相對表達量

*:與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05。

2.3轉染mimics的Eca109和EC9706細胞的克隆形成能力見圖1、表2。轉染mimics后Eca109和EC9706細胞克隆形成能力較空白對照和陰性對照降低(P<0.05)。

2.4轉染mimics的Eca109和EC9706細胞的凋亡情況見表3。轉染mimics的Eca109和EC9706細胞凋亡率較空白對照和陰性對照升高(P<0.05)。

2.5轉染mimics的Eca109和EC9706細胞的增殖能力見表4、5。轉染mimics的Eca109和EC9706細胞增殖能力較空白對照和陰性對照降低(P<0.05)。

A～C：空白對照組、陰性對照組、mimics組Eca109細胞；D～F：空白對照組、陰性對照組、mimics組EC9706細胞。 圖1 細胞克隆實驗

組別nEca109EC9706空白對照組3450.0±26.5323.3±15.3陰性對照組3443.3±15.3313.3±15.3mimics組3160.0±20.0*146.7±15.3*F184.975126.619P<0.001<0.001

*:與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05。

表3 3組細胞凋亡率的比較 %

*:與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05。

表4 Eca109細胞增殖能力測定結果(n=3)

*:與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05。

表5 EC9706細胞增殖能力測定結果(n=3)

*:與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05。

2.6轉染mimics的Eca109和EC9706細胞mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白的表達見圖2。轉染mimics的Eca109和EC9706細胞中mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達水平均降低。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：mimics組。 圖2 mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白的檢測

3 討論

1993年，Lee等[7]首先在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發現了第一個可時序調控胚胎后期發育的miRNA——lin-4，之后Reinhart等[8]又在同類線蟲中發現了第二個異時性開關基因let-7，接著人們相繼在細菌、動植物與人體內發現大量miRNA。近年來研究[2-9]發現，miRNA不僅在生物體細胞分化、增殖、代謝以及免疫應答等生命活動中發揮重要作用，而且與腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病、神經性疾病、內分泌疾病及免疫性疾病等的發生發展密切相關。在腫瘤中，miRNA通常以癌基因或抑癌基因的角色參與腫瘤的發生發展。Huo等[10]研究發現，miR-144a-3p可通過靶向mTOR抑制人唾液腺腺樣癌細胞的增殖，促進細胞凋亡；Chen等[11]發現，miR-451在多種結直腸癌組織中高表達，其表達與mTORC1的活性和FSCN1的表達密切相關，miR-451高表達可抑制AMPK的活性，導致mTORC1過度激活和FSCN1高表達，從而使細胞具有較高的遷移和增殖能力，促進結直腸癌的發生發展。Janaki等[12]研究發現，在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，miR-15/16可通過抑制p70S6K1的表達抑制細胞增殖并使細胞周期停留在G1階段。

miR-199a定位在人染色體19q13.2[13]。miR-199a-3p在多種腫瘤組織中異常表達，如卵巢癌、胃癌、肝癌、結直腸癌、胰腺癌、子宮內膜癌、乳頭狀甲狀腺癌、膠質瘤、骨肉瘤等，影響癌癥的發生發展[9-16]。Troppan等[14]發現，miR-199a和miR-497可增強彌散型B淋巴細胞瘤對化療的敏感性，延長患者的生存期；Tian等[15]發現miR-199a-3p和miR-34a可通過影響p53信號通路誘導人骨肉瘤細胞凋亡；Peng等[16]研究發現，miR-199a-3p在胃癌組織中表達下調，上調其表達可抑制胃癌細胞增殖。該研究結果證實，ESCC細胞中也存在miR-199a-3p的表達；上調其表達可明顯抑制細胞增殖并能促進細胞凋亡，降低mTORC1/p-p70S6K信號通路相關蛋白以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，說明miR-199a-3p可能是通過調節mTORC1/p-p70S6K信號通路來影響ESCC細胞的增殖和凋亡。

目前有關miR-199a-3p在ESCC中的研究較少，該研究也僅對其進行了體外研究。總之，miR-199a-3p在ESCC的發生發展中具有重要作用，深入探討miR-199a-3p在ESCC中的作用及相關機制可能為ESCC的臨床診斷和分子治療提供新的靶標和策略。

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(2016-12-03收稿 責任編輯王 曼)

Expression of miR-199a-3p and its effects on cell proliferation and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells

GAOPan,LUZhaoming,LIUXiangyan,ZHANGXingli,FANCheng,SHIYingying,HOUGuiqin

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-199a-3p;esophageal squamous cell carcinoma;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To investigate the expression of miR-199a-3p in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) cells and its effects on cell proliferation and apoptosis. Methods: The expression of miR-199a-3p in five ESCC cell lines(TE1, Eca109, EC9706, KYSE450, KYSE790) was detected by Real-time PCR. miR-199a-3p mimics was transfected into Eca109 and EC9706 cells, respectively by siRNA-MateTM, and then the colony capacity, proliferation capacity and apoptosis rate were detected by colony formation assay, CCK-8 assay and Annexin V-FITC and PI staining method, respectively, the expressions of mTOR, p-p70S6K and Bcl-2 protein were detected by Western blot. Cells without transfection were the blank control, and cells transfected with negative mimics were the negative control.Results: miR-199a-3p expressed in five ESCC cell line cells, and the expression level had no significant difference(P>0.05). Compared with negative control and blank control, the expression level of miR-199a-3p in Eca109 and EC9706 cells transfected with miR-199a-3p mimics increased(P<0.001), the colony formation capacity and proliferation capacity decreased(bothP<0.001), the apoptosis rate increased(P<0.001), and the protein expressions of mTOR, p-p70S6K and Bcl-2 decreased. Conclusion: miR-199a-3p might inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis in ESCC cells through mTORC1/p70S6K signal pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.001

R735.1

*國家自然科學基金項目 30901778；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 162300410122

#通信作者，女，1977年6月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細胞分子生物學，E-mail:hougq@zzu.edu.cn