M2型腫瘤相關巨噬細胞浸潤與食管鱗癌發生、浸潤及轉移的關系*

張 冰，孫淼淼，韋 娜，賀璐璐，王正洋，張紅新，陳奎生#

1)鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科 鄭州 450003 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科；河南省腫瘤病理重點實驗室 鄭州 450052 3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450003

M2型腫瘤相關巨噬細胞浸潤與食管鱗癌發生、浸潤及轉移的關系*

張 冰1)，孫淼淼1)，韋 娜2)，賀璐璐3)，王正洋2)，張紅新2)，陳奎生2)#

1)鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科 鄭州 450003 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科；河南省腫瘤病理重點實驗室 鄭州 450052 3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450003

腫瘤相關巨噬細胞；CD206；IL-8；MCP-1；浸潤轉移

目的：探討M2型腫瘤相關巨噬細胞(M2型TAM)浸潤與食管鱗癌發生、浸潤、轉移的關系及其可能機制。方法采用免疫組化SP法分別檢測50例食管鱗癌和50例正常食管黏膜組織中CD206(M2型TAM特異性標志物)、IL-8、MCP-1蛋白的表達；應用原位雜交方法分別檢測上述組織中IL-8、MCP-1 mRNA的表達。結果食管鱗癌組織中M2型TAM的浸潤數量多于正常食管黏膜(P=0.032)；食管鱗癌間質中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA陽性表達率高于正常食管黏膜組織(P<0.05)；M2型TAM浸潤數量與食管鱗癌的浸潤深度、淋巴結轉移及患者的TNM分期有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別無關(P>0.05)；食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與IL-8、MCP-1蛋白和mRNA的表達呈正關聯(蛋白：rP=0.432、0.315；mRNA：rP=0.373、0.332，P均<0.05)。結論M2型TAM與食管鱗癌的發生、浸潤、轉移有關，其機制可能與TAM分泌的趨化因子IL-8和MCP-1有關。

食管鱗癌是消化道惡性腫瘤中最常見的組織學類型，其浸潤轉移是引起患者死亡的主要原因之一[1]。浸潤到腫瘤組織中的巨噬細胞又被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAM)。TAM主要包括兩種類型：經典活化的巨噬細胞，即M1型TAM，發揮殺傷和抑制腫瘤細胞的作用；替代性活化的巨噬細胞，即M2型TAM，主要促進腫瘤的發生、發展[2]。近年來研究[3]發現不同活化表型的TAM具有不同的特異性標記物，而甘露糖受體,即CD206是M2型TAM的特異性標志物之一。研究[4]表明M2型TAM與腫瘤發生發展和浸潤轉移密切相關，可能與其自分泌或旁分泌多種細胞因子有關，趨化因子IL-8、MCP-1、MIP-1在介導局部免疫的同時，其促進腫瘤血管生成的作用也日漸為人們所重視,但有關TAM與食管鱗癌發生及浸潤轉移關系的研究尚未見報道。該研究探討M2型TAM浸潤與食管鱗癌發生、浸潤、轉移的關系及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料50例食管鱗癌和50例正常食管黏膜組織為鄭州大學第一附屬醫院2010年1月至2011年12月的手術切除標本，臨床資料完整。50例中男26例，女24例；年齡38～80歲，≥60歲者30例，<60歲者20例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期28例；浸潤到黏膜下層或淺肌層者10例，浸潤到深肌層者12例，浸潤至全層或外膜者28例；伴有淋巴結轉移者25例。CD206、IL-8和MCP-1一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒、SP免疫組化通用試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，胃蛋白酶、預雜交液、原位雜交封閉液、BCIP/NBT購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2食管鱗癌和正常食管黏膜組織中CD206、IL-8和MCP-1蛋白表達的檢測各組織標本經體積分數10%中性甲醛溶液固定、常規石蠟包埋、脫蠟水化、抗原修復，行SP法染色，滴加用PBS稀釋的一抗(CD206、IL-8和MCP-1均按1100稀釋)，4 ℃濕盒內過夜。次日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。以0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對照。結果判定：①CD206陽性表達主要位于腫瘤間質巨噬細胞的胞質，呈棕黃色顆粒，M2型TAM計數方法參考文獻[5-6]。②IL-8、MCP-1的陽性表達均位于腫瘤間質巨噬細胞的胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。判定標準參照文獻[7]。

1.3食管鱗癌和正常食管黏膜組織中IL-8和MCP-1mRNA表達的檢測各組織標本經含1/1 000 DEPC的體積分數10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4 μm切片，置于60 ℃烤箱中烘烤3 h，室溫下冷卻，于4 ℃冰箱中保存備用。原位雜交中IL-8探針序列：5’-TCCGTAATTCAACACAGCACT-3’;MCP-1 探針序列：5’-TGCAGATTCTTGGGTTGTGGA-3’，由上海生物工程有限公司設計并合成。體積分數3% H2O2滅活內源性過氧化物酶活性；體積分數3%枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37 ℃消化20 min，暴露mRNA核酸片段；滴加雜交液，42 ℃溫浴箱中過夜；洗滌、封閉、復染、封片。以不含探針的預雜交液孵育標本作為陰性對照。結果判定：IL-8、MCP-1 mRNA的陽性表達主要位于腫瘤間質巨噬細胞的胞質，呈紫藍色顆粒；判定標準參照文獻[7]。

1.4統計學處理使用SPSS 17.0處理數據，正常食管黏膜和食管鱗癌間質中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達陽性率的比較采用χ2檢驗，不同臨床病理特征的食管鱗癌患者M2型TAM浸潤數量的比較采用兩獨立樣本t檢驗；食管鱗癌間質M2型TAM的浸潤數量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達的關系采用Pearson列聯系數分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1食管鱗癌和正常食管黏膜組織中M2型TAM的計數結果CD206是M2 型 TAM的特異性標志物之一。免疫組化結果顯示CD206陽性表達主要位于腫瘤間質巨噬細胞的胞質，呈棕黃色顆粒(圖1)。單個高倍視野下，食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量(28.66±14.06)多于正常食管黏膜組織(7.46±2.15)(t=19.326，P=0.032)。

圖1 正常食管黏膜(A)和食管 鱗癌(B)間質中CD206蛋白的陽性表達(SP，×100)

2.2正常食管黏膜和食管鱗癌間質中IL-8、MCP-1的表達食管鱗癌間質中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA陽性表達率高于正常食管黏膜，結果見圖2、表1。

1：IL-8蛋白；2：MCP-1蛋白；3：IL-8 mRNA；4：MCP-1 mRNA。 圖2 正常食管黏膜(A)和食管鱗癌(B)間質中IL-8、MCP-1蛋白和mRNA的表達(SP和BCIP/NBT，×100)

2.3食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與食管鱗癌患者人口學特征及臨床病理學特征的關系

CD206標記的M2型TAM的浸潤數量與食管鱗癌患者的性別、年齡無關，而與食管鱗癌的浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期密切相關，見表2。

2.4食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達的關系食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA的表達呈正關聯(表3～6)。

表2 食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與患者人口學特征及臨床病理特征的關系

表3 食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與IL-8蛋白表達的關系 例

rP=0.432,P<0.001。

表4 食管鱗癌間質中M2 型 TAM的浸潤數量與MCP-1蛋白表達的關系 例

rP=0.315,P=0.019。

表5 食管鱗癌間質中M2型TAM的浸潤數量與IL-8 mRNA表達的關系 例

rP=0.373,P=0.004。

表6 食管鱗癌間質中M2 型 TAM的浸潤數量與MCP-1 mRNA表達的關系 例

rP=0.332,P=0.013。

3 討論

食管鱗癌的發生、發展是一個多基因、多步驟、多階段,由體內外多種因素參與并相互作用的過程。盡管在早期診斷、腫瘤篩選以及治療方面的技術不斷進步，但目前對食管鱗癌侵襲、轉移方面的機制了解甚少，食管鱗癌患者的死亡率仍很高[8]。近來研究[9]發現，在腫瘤間質中的巨噬細胞不但沒有發揮抗腫瘤的作用，反而參與了腫瘤的發生發展和侵襲轉移。研究[5]證實：惡性腫瘤組織中TAM計數越高，腫瘤的進展越快，癌組織越容易發生轉移，預后也越差，所以TAM可作為評估惡性腫瘤預后的一個客觀指標。

IL-8具有趨化活性，在腫瘤組織中注射IL-8可以使處于靜止期的CD4+細胞和NK細胞活化，促進腫瘤細胞的浸潤和增殖[10]。Fujimoto等[11]在對宮頸癌的研究中發現，TAM可分泌IL-8，其水平與腫瘤中微血管的數量相關。因此,IL-8可作為一種潛在的靶向治療細胞因子，抑制其表達在腫瘤的生物學治療中將發揮重要作用。

MCP-1是細胞因子中的一員，具有多種生物學功能，它可以特異性地趨化單核細胞使其分化為巨噬細胞，從而促進TAM浸潤。有研究[12]發現：MCP-1在胃癌間質中的陽性表達率高于正常組織，且其陽性表達率隨著癌組織浸潤深度的增加而升高；MCP-1可以促進巨噬細胞的聚集，胃癌間質中的巨噬細胞在腫瘤細胞分泌的細胞因子影響下分泌MCP-1，進一步誘導更多的單核巨噬細胞遷移、浸潤到胃癌間質組織。因此，MCP-1與TAM之間可以相互影響相互調控，共同促進腫瘤的生長轉移。

該研究結果顯示M2型TAM與食管鱗癌的發生、浸潤、轉移有關，且食管鱗癌組織間質中M2型TAM的浸潤數量與MCP-1、IL-8蛋白及mRNA的表達有關。食管鱗癌發生后，腫瘤細胞分泌趨化因子IL-8和MCP-1，二者可促進巨噬細胞在腫瘤部位聚集。TAM一方面通過上調IL-8、MCP-1表達來促進腫瘤細胞的浸潤轉移，另一方面，TAM本身也能分泌趨化因子IL-8和MCP-1，這樣就形成了一個復雜的調控體系，增強了腫瘤細胞的侵襲能力，加速了食管鱗癌的侵襲和轉移[4]。

[1] 王立東,鄭樹.河南食管癌高發區人群食管和賁門癌變機制[J].鄭州大學學報(醫學版),2002,37(6):717

[2] 王青山,倪虹,魏曉麗,等.IL-6對M1型巨噬細胞向腫瘤相關M2型巨噬細胞轉化過程的誘導作用[J].解放軍醫學雜志,2009,34(8):927

[3] 李康,郭強,王翠妮，等.M1型和M2型巨噬細胞表型的比較分析[J].現代免疫學,2008,28(3):177

[4] 吳婷,周武雄.腫瘤相關巨噬細胞的極化與腫瘤的發展[J].現代腫瘤醫學,2015,23(12):1753

[5] LEWIS CE,POLLARD JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res,2006,66(2):605

[6] 劉福安,杜玉開.pin1基因在卵巢惡性腫瘤組織中的表達及與CyclinD1、Ki-67的關系[J].華中科技大學學報(醫學版),2008,37(2):239

[7] ZHANG S,LI L,LIN JY,et al.Imbalance between expres-sion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in invasiveness and metastasis of human gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol,2003,9(5):899

[8] 葉文廣,姚青林,張明鑫,等.miR-520a調控ErbB4的表達并抑制食管鱗癌細胞的增殖與侵襲[J].南方醫科大學學報,2014,34(2):164

[9] 詹慶華,陳維榮.腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤微淋巴管生成的研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志,2009,29(2):165

[10]熊玉琪,任秀寶，盧斌峰，等.腫瘤浸潤CD4+T淋巴細胞的抗腫瘤免疫機制[J].臨床檢驗雜志，2015，33(12):919

[11]FUJIMOTO J,SAKAGUCHI H,AOKI I,et al.Clinical implications of expression of interleukin 8 related to angiogenesis in uterine cervical cancers[J].Cancer Res,2000,60(10):2632

[12]鄭海燕,王興芬,潘彥珞,等.胃癌組織中MCP-1、MMP-9的表達與間質中TAMs浸潤的關系[J].臨床腫瘤學雜志,2010,15(3):218

(2017-01-09收稿 責任編輯徐春燕)

Relationship of infiltration of M2 type tumor-associated macrophages with occurrence, invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

ZHANGBing1)，SUNMiaomiao1)，WEINa2),HELulu3)，WANGZhengyang2)，ZHANGHongxin2)，CHENKuisheng2)1)DepartmentofPathology,theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003

2)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity；HenanKeyLaboratoryofTumorPathology,Zhengzhou450052 3)China-US(Henan)HormelCancerInstitute,Zhengzhou450003

tumor associated macrophage；CD206;IL-8；MCP-1；invasion and metastasis

Aim: To investigate the relationship between the infiltration of M2 type tumor associated macrophages(M2 type TAM) and the occurrence, invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) and its possible mechanism.Methods: The expressions of CD206, IL-8, MCP-1 proteins and IL-8, MCP-1 mRNA were detected using immunohistochemical method andinsituhybridization in 50 cases of the interstitial of ESCC and 50 cases of normal esophageal mucosa.Results: The number of M2 type TAM in the interstitial of ESCC was significantly higher than that in normal esophageal mucosa tissue(P=0.032); the positive expression rates of IL-8,MCP-1 protein and mRNA in the interstitial tissue of ESCC were significantly higher than those in the interstitial tissue of normal esophageal mucosa(P<0.05). The number of M2 type TAM was significantly associated with the depth of tumor invasion, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05), but not with the patients′ age or gender(P>0.05). The number of M2 type TAM in ESCC was positively correlated with the expressions of IL-8,MCP-1 protein(rP=0.432,0.315) and mRNA(rP=0.373,0.332，P<0.05).Conclusion: M2 type TAM may be related with the occurrence, invasion and metastasis of ESCC, and the mechanism may be related with chemotactic factor IL-8 and MCP-1 secreted by M2 type TAM.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.003

*河南省重點科技攻關計劃項目 132102310086；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 142300410076；國家自然科學基金 81272370

R735.1

#通信作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail：chenksh2002@163.com