食管鱗癌Eca109細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1的調控作用*

凡 丞，魯照明，張幸麗，田 菲，白一汝，趙 琦，彭柯崢，劉宏民，侯桂琴

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

食管鱗癌Eca109細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1的調控作用*

凡 丞，魯照明，張幸麗，田 菲，白一汝，趙 琦，彭柯崢，劉宏民，侯桂琴#

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

食管鱗癌；PI3K/AKT/mTOR通路；LSD1；H3K4me2

目的：探討食管鱗癌Eca109細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1的調控作用。方法用不同濃度的PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑LY294002(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μmol/L)、RAD001(0.05、0.50、5.00、10.00、20.00和50.00 μmol/L)分別處理Eca109細胞24、48 h，采用CCK-8實驗檢測細胞增殖；然后分別用0、10、20 μmol/L LY294002或RAD001處理Eca109細胞24 h或20 μmol/L LY294002或RAD001處理不同時間(0～72 h)，采用Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路因子、LSD1及組蛋白H3K4me2表達的變化。結果LY294002、RAD001處理后，食管鱗癌細胞增殖受抑，且隨濃度的增加，抑制作用有增強的趨勢(P<0.05)；LY294002抑制Eca109細胞中p-p70S6K的表達，上調Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)以及組蛋白H3K4me2的表達；而RAD001抑制了Raptor、Rictor、p-p70S6K表達，增加p-Akt(Ser473)的表達，并且下調LSD1表達，上調組蛋白H3K4me2的表達(P<0.05)。結論PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1存在調控作用。

食管鱗癌是我國尤其是河南省高發的惡性腫瘤,其易發生耐藥，復發率高且5 a生存率低，因此探索其發生的分子機制及尋找分子治療靶點具有重要意義[1]。研究[2]認為，腫瘤的發生發展與組蛋白的甲基化和去甲基化水平的動態平衡關系密切，組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)能夠特異性去除組蛋白H3K4me1/2或H3K9me1/2的甲基化；LSD1作為一種特異性的去甲基化酶在惡性腫瘤的發生發展中扮演著重要的角色，并且在多種惡性腫瘤中都存在LSD1的高表達[3]。PI3K/AKT/mTOR信號通路激活能引起腫瘤細胞蛋白質的合成增加，促進腫瘤細胞的增殖、遷移，是腫瘤發生的主要調控通路之一[4]。腫瘤發生過程中PI3K/AKT/mTOR信號通路與LSD1之間是否存在調控關系尚不清楚。該研究以人食管鱗癌細胞株Eca109為研究對象，利用PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑RAD001分別抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，探討PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1的調控作用及對其功能的影響，為探討食管鱗癌的分子發生機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料Eca109購自上海中科院細胞庫。RPMI 1640培養基和胎牛血清購自以色列BI公司，LY294002、RAD001均購自美國MCE公司，LSD1抗體購自美國Abcam公司，H3K4me2、Raptor、Rictor、p-p70S6K、p-Akt(Ser473)及內參GAPDH和H3抗體均購自美國CST公司，組蛋白提取試劑盒購自美國EpIGENTEK公司。LY294002和RAD001均用DMSO配制成濃度為20 mmol/L的母液并于-20 ℃保存。

1.2細胞培養細胞用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基在37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中培養。

1.3CCK-8實驗將Eca109細胞接種于96孔板，6 000個/孔，過夜培養，然后分別用不同濃度的LY294002(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μmol/L)或RAD001(0.05、0.50、5.00、10.00、20.00和50.00 μmol/L)處理，每個濃度設6個復孔。用未處理細胞作為空白組，并設置對照組(只含RPMI 1640培養基)以消除培養基干擾。繼續培養24、48 h后每孔加入5 μL CCK-8，繼續培養4 h，用酶標儀測定細胞在450 nm波長處的光密度值。計算細胞增殖抑制率，并進一步算出LY294002和RAD001的IC50。細胞增殖抑制率=1-(加藥孔細胞光密度值-空白孔細胞光密度值)/(對照孔細胞光密度值-空白孔細胞光密度值)×100%。實驗重復3次。

1.4Westernblot將Eca109細胞接種于6孔板，過夜培養后分別加入0、10和20 μmol/L的LY294002或RAD001處理24 h；或分別用20 μmol/L LY294002或RAD001處理細胞0、24、36、48和72 h。提取上述處理細胞及未處理細胞總蛋白及組蛋白，將40 μg蛋白(組蛋白為2 μg)經SDS-PAGE分離，電轉至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后分別加入H3K4me2、Raptor、Rictor、p-p70S6K、p-Akt(Ser473)和LSD1一抗及內參GAPDH和H3抗體(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；第2天用PBST洗3遍，加入相應二抗(按110 000稀釋)，室溫孵育2 h后PBST洗3遍，ECL化學底物發光液顯影后暗室曝光，條帶用Image J軟件進行灰度分析。目的蛋白相對表達量用目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示。實驗均重復3次。

1.5統計學處理應用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較各組細胞增殖抑制率、mTOR通路相關信號分子、LSD1和組蛋白H3K4me2表達的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1LY294002、RAD001對Eca109細胞增殖的影響CCK-8結果顯示，LY294002和RAD001處理24和48 h均能明顯抑制Eca109細胞增殖，且隨著藥物濃度的增加，細胞增殖抑制率升高(表1、2)。LY294002在24 h和48 h的IC50分別為(45.618±3.219)和(19.167±3.142) μmol/L，RAD001分別為(49.868±4.488)和(18.263±5.621) μmol/L。

表1 LY294002對Eca109細胞增殖的抑制作用(n=3) %

表2 RAD001對Eca109細胞增殖的抑制作用(n=3) %

2.2LY294002和RAD001對Eca109細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關信號分子表達的影響

LY294002處理后，Eca109細胞中p-p70S6K的表達下降，Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)的表達上調，且隨著LY294002濃度的增加，這種變化更加明顯；而RAD001處理Eca109細胞后，Raptor、Rictor、p-p70S6K的表達量隨著RAD001濃度的增加有降低的趨勢，而p-Akt(Ser473)的表達則有不同程度的增加。見圖1，表3、4。

2.3LY294002和RAD001對Eca109細胞LSD1及組蛋白H3K4me2表達的影響LY294002可使H3K4me2的表達上調，且H3K4me2的表達隨時間的延長和劑量的增大有升高的趨勢，而LSD1的表達沒有明顯變化。RAD001能抑制LSD1的表達，升高H3K4me2的表達，且隨時間的延長和劑量的增加，其作用更為顯著。見圖2、3及表5、6。

上：LY294002；下：RAD001；1～3：分別為0、10、20 μmol/L。 圖1 不同濃度 LY294002和 RAD001對PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響

c(LY294002)/(μmol·L-1)RaptorRictorp-p70S6Kp-Akt(Ser473)00.334±0.0700.490±0.1200.458±0.0600.511±0.125100.779±0.049*0.673±0.1140.390±0.0620.806±0.165201.020±0.027*1.086±0.161*0.170±0.043*0.972±0.152*F136.59815.83621.8617.421P<0.0010.0040.0020.024

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05。

表4 RAD001對Eca109細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響(n=3)

*：與0 μmol/L相比，P<0.05。

1～3：分別為0、10、20 μmol/L LY294002處理24 h；4～8：分別為20 μmol/L LY294002處理0、24、36、48、72 h。 圖2 LY294002對Eca109細胞中LSD1及組蛋白H3K4me2表達的影響

c/(μmol·L-1)LY294002LSD1H3K4me2RAD001LSD1H3K4me201.411±0.1240.698±0.1081.010±0.0930.707±0.202101.384±0.1471.219±0.174*0.871±0.0551.280±0.074*201.397±0.1081.321±0.050*0.481±0.221*1.302±0.098*F0.0342.60211.20618.327P0.9670.0020.0090.003

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05。

表6 20 μmol/L LY294002或RAD001作用不同時間對Eca109細胞 LSD1及H3K4me2表達的影響(n=3)

*：與0 h組相比，P<0.05。

3 討論

LSD1是第一個發現的去甲基化酶，能夠催化組蛋白H3K4me1/2和H3K9me1/2脫甲基，抑制或激活轉錄，其在許多類型的惡性腫瘤中高表達，并且與腫瘤發生過程中的致癌作用密切相關。然而，腫瘤中導致LSD1上調的機制目前仍不明確[5-7]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在腫瘤細胞增殖和分化中起重要作用[8-10]，但目前關于PI3K/AKT/mTOR信號通路與LSD1關系的研究很少，在惡性腫瘤發生發展過程中具體調控機制還不清楚。有報道[11-12]證實，LSD1能夠和一些小分子形成共抑制復合物來調控PI3K/AKT/mTOR通路上游抑制子PTEN的轉錄。Yokoyama 等[13]的研究發現LSD1能夠調控PTEN的表達，在LSD1被抑制的情況下，癌細胞的生長也明顯被抑制。Shao等[14]發現在卵巢癌中EGFR能夠通過PI3K/AKT通路調節LSD1的表達并能影響其功能，從而促進腫瘤細胞的轉移。這些實驗都證明LSD1與mTOR通路之間存在著某種調控關系。

1～3：分別為0、10、20 μmol/L RAD001處理24 h；4～8：分別為20 μmol/L RAD001處理0、24、36、48、72 h。 圖3 RAD001對Eca109細胞中 LSD1及組蛋白H3K4me2表達的影響

為了探討食管鱗癌細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1的調控作用，作者首先研究了PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002和RAD001對Eca109細胞增殖的影響及其對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用，然后觀察抑制該通路后細胞中LSD1及組蛋白表達的變化。結果發現，LY294002和RAD001均能抑制Eca109細胞增殖，并且能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，且二者均能夠通過調節LSD1的去甲基化功能從而上調組蛋白H3K4me2的表達，并且RAD001對LSD1的表達也具有抑制作用。由此，初步推斷在食管鱗癌中LSD1可能處在PI3K/AKT/mTOR信號通路的下游，且受此信號通路的調控。

Djukom等[15]和Werzowa等[16]的研究發現，在治療胰腺神經內分泌腫瘤和黑色素瘤時，單獨應用RAD001或LY294002能夠上調p-Akt(Ser473)的表達，促進惡性腫瘤的發生。該研究亦顯示食管鱗癌細胞中也存在類似的情況，這可能因為mTOR通路存在多條反饋回路，當mTOR被抑制后能夠引起該通路的負反饋激活[17]。這也可能是臨床單獨應用RAD001效果相對較差的原因，細胞增殖實驗中食管鱗癌細胞對二者的敏感性不高(藥物作用48 h其IC50仍接近20 μmol/L)也可能是因為Akt的負反饋激活。

總之，研究初步證實了Eca109細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路對LSD1存在調控作用，為從表觀遺傳學的角度治療食管鱗癌提供了新思路。

[1] CHEN J,KWONG DL,CAO T,et al.Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC):advance in genomics and molecular genetics[J].Dis Esophagus,2015,28(1):84

[2] FALKENBERG KJ,JOHNSTONE RW.Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders[J].Nat Rev Drug Discov,2014,13(9):673

[3] SUN G,ALZAYADY K,STEWART R,et al.Histonedemethylase LSD1 regulates neural stem cell proliferation[J].Mol Cell Biol,2010,30(8):1997

[4] PRESNEAU N,SHALABY A,IDOWU B,et al.Potential therapeutic targets for chordoma: PI3K/AKT/TSC1/TSC2/mTOR pathway[J].Br J Cancer,2009,100(9):1406

[5] BURG JM,GONZALEZ JJ,MAKSIMCHUK KR,et al.Lysine-specific demethylase 1A(KDM1A/LSD1):product recognition and kinetic analysis of full-length histones[J].Biochemistry,2016,55(11):1652

[6] 翟曜耀,劉曉霞,趙越.賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1作用機制及其生物學功能的研究進展[J].生命科學，2012,24(1):7

[7] LI Y,TIAN X,SUI CG,et al.Interference of lysine-specific demethylase 1 inhibits cellular invasion and proliferation in vivo in gastric cancer MKN-28 cells[J].Biomed Pharmacother,2016,82:498

[8] DUFFY MJ,MCGOWAN PM,GALLAGHER WM.Cancer invasion and metastasis: changing views[J].J Pathol,2008,214(3):283

[9] TOKER A.Achieving specificity in Akt signaling in cancer[J].Adv Biol Regul,2012,52(1):78

[10]FOLLO MY,MANZOLI L,POLI A,et al.PLC and PI3K/Akt/mTOR signalling in disease and cancer[J].Adv Biol Regul,2015,57:10

[11]LIN Y,KANG T,ZHOU BP.Doxorubicin enhances Snail/LSD1-mediated PTEN suppression in a PARP1-dependent manner[J].Cell Cycle,2014,13(11):1708

[12]YOKOYAMA A,TAKEZAWA S,SCHüLE R,et al.Transrepressive function of TLX requires the histone demethylase LSD1[J].Mol Cell Biol,2008,28(12):3995

[13]YOKOYAMA A,IGARASHI K,SATO T,et al.Identification of myelin transcription factor 1(MyT1) as a subunit of the neural cell type-specific lysine-specific demethylase 1 (LSD1) complex[J].J Biol Chem,2014,289(26):18152

[14]SHAO G,WANG J,LI Y,et al.Lysine-specific demethylase 1 mediates epidermal growth factor signaling to promote cell migration in ovarian cancer cells[J].Sci Rep,2015,5:15344

[15] DJUKOM C, PORRO LJ, MRAZEK A, et al. Dual inhibition of PI3K and mTOR signaling pathways decreases human pancreatic neuroendocrine tumor metastatic progression[J]. Pancreas, 2014, 43(1):88

[16]WERZOWA J,CEJKA D,FUEREDER T,et al.Suppression of mTOR complex 2-dependent AKT phosphorylation in melanoma cells by combined treatment with rapamycin and LY294002[J].Br J Dermatol,2009,160(5):955

[17]EFEYAN A,SABATINI DM.mTOR and cancer: many loops in one pathway[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):169

(2016-12-05收稿 責任編輯徐春燕)

Regulation effects of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway on LSD1 in Eca109 cells

FANCheng,LUZhaoming,ZHANGXingli,TIANFei,BAIYiru,ZHAOQi,PENGKezheng,LIUHongmin,HOUGuiqin

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

esophageal squamous cell carcinoma;PI3K/AKT/mTOR signaling pathway;LSD1;H3K4me2

Aim: To explore the regulation effects of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway on LSD1 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) Eca109 cells. Methods: Eca109 cells were treated with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitor LY294002 or RAD001 with different concentrations for 24, 48 h, then the proliferation of cells was detected by CCK-8 assay. Eca109 cells were treated with LY294002 or RAD001 with different concentration for 24 h,or treated with LY294002 or RAD001 at the same concentration for different time,then the expressions of proteins in PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, LSD1 and histone H3K4me2 were detected by Western blot, respectively. Results: The proliferation of Eca109 cells was significantly inhibited by LY294002 or RAD001, and the inhibition effects increased along with the increase of the concentration(P<0.05); LY294002 inhibited the expression of p-p70S6K and promoted the expressions of Raptor, Rictor, p-Akt(Ser473) and histone H3K4me2; while RAD001 inhibited the expressions of Raptor, Rictor, p-p70S6K, up-regulated the expressions of p-Akt(Ser473) and histone H3K4me2, and down-regulated that of LSD1(P<0.05). Conclusion: The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway has regulation effects on LSD1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.004

R735.1

#通信作者，女，1977年6月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細胞分子生物學，E-mail:hougq@zzu.edu.cn

*國家自然科學基金重點項目 81430085；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 162300410122