HPK1在乳腺癌組織中的表達及HPK1過表達對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的影響*

王嬌嬌，范智蕊，李礪鋒，丁顯飛，周學良，楊子悅，袁 博，許振濤，馬丙鈞，趙 杰，王留興#

1)鄭州大學第一附屬醫院超聲科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州450052 3)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 4)鄭州大學第一附屬醫院綜合ICU 鄭州 450052 5)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052#通信作者，男，1952年2月生，本科，教授，主任醫師，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基礎與臨床，E-mail:lxwang2006@126.com

HPK1在乳腺癌組織中的表達及HPK1過表達對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的影響*

王嬌嬌1)，范智蕊2)，李礪鋒2,3)，丁顯飛2,4)，周學良2)，楊子悅4)，袁 博2,4)，許振濤2,4)，馬丙鈞5)，趙 杰5)，王留興2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院超聲科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州450052 3)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 4)鄭州大學第一附屬醫院綜合ICU 鄭州 450052 5)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052#通信作者，男，1952年2月生，本科，教授，主任醫師，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基礎與臨床，E-mail:lxwang2006@126.com

HPK1；過表達；乳腺癌；MCF-7細胞；增殖；凋亡

目的：檢測造血祖細胞激酶1(HPK1)在人非特異型浸潤性乳腺癌組織及乳腺癌細胞中的表達，并構建HPK1慢病毒載體以探究HPK1過表達對人乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響。方法采用Western blot檢測48例乳腺癌組織和配對癌旁組織中HPK1蛋白的表達，采用Western blot、RT-PCR法檢測正常乳腺上皮細胞(MCF10A)和乳腺癌MCF-7細胞中HPK1的表達水平。PCR擴增HPK1序列，構建慢病毒pCDH-HPK1-puro重組載體，包裝病毒、轉染MCF-7細胞(過表達組)，以感染空載體病毒的MCF-7細胞作為對照組，分別采用Western blot、RT-PCR檢測2組細胞HPK1的表達水平，MTT法檢測細胞增殖能力的變化，流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期。結果與癌旁組織相比，HPK1蛋白在乳腺癌組織中低表達(P=0.036)。與MCF10A細胞相比，HPK1蛋白及mRNA在MCF-7細胞中低表達；與對照組相比，過表達組中HPK1蛋白及mRNA的表達水平上調，細胞增殖能力下降，細胞凋亡率升高，G0/G1期細胞比例升高(P均<0.05)。結論HPK1在乳腺癌組織及細胞中低表達，HPK1過表達可抑制MCF-7細胞增殖和誘導凋亡，并使細胞周期阻斷在G0/G1期。

乳腺癌已經成為全球女性癌癥死亡的第二大原因，其死亡人數占女性癌癥總死亡人數的14%[1]。美國癌癥協會預計，2017年美國乳腺癌將新發約255 180例、死亡41 070例[1]。目前，乳腺癌在手術治療、放療、化療和內分泌治療等方面已經取得了明顯的療效，但其5 a生存率依然較低。因此尋找新的改善乳腺癌患者預后的基因靶點有著重要的意義[2]。造血祖細胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1)是造血系統特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，哺乳動物Ste-20相關蛋白激酶MAP4K家族成員之一[3]。HPK1在免疫反應和炎癥信號通路以及造血細胞的應激反應、增殖、凋亡中發揮著重要作用[4],且其可能參與腫瘤的免疫治療[5]。近年發現，HPK1與胰腺癌[6]、肺癌[7-8]、膀胱癌[9]等多種惡性腫瘤的發生發展有關。作者的前期研究[10]發現HPK1在乳腺癌中呈現低表達，與非特異型浸潤性乳腺癌(invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified, IDC-NOS)的發生發展有關。該研究通過構建慢病毒載體獲得HPK1過表達的慢病毒顆粒，并感染乳腺癌MCF-7細胞，以探究HPK1過表達對人乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，為未來HPK1應用于乳腺癌的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料MCF-7細胞、293T細胞、MCF10A細胞及慢病毒包裝質粒pCDH-puro、pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG均由鄭州大學腫瘤生物學研究室儲存。體積分數10%胎牛血清、DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液購自HyClone公司。KOD FX DNA聚合酶購自Toyobo公司，核酸內切酶、DNA連接酶購自TaKaRa公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及PCR相關引物購自上海生工生物工程有限公司。兔抗人HPK1一抗購自美國Abgent公司，β-actin一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司。RNA抽提試劑、反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、2.5 g/L胰蛋白酶等購自北京索萊寶生物科技有限公司。無內毒素質粒提取試劑盒、磷酸鈣轉染試劑盒購自Tiangen公司。 MTT和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白表達的檢測采用Western blot法。選取鄭州大學第一附屬醫院乳腺外科收治的48例病理證實為ER陽性的IDC-NOS患者新鮮冰凍的癌組織和癌旁組織，剪碎研磨后，加入裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量測定，SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。加入一抗HPK1抗體、GAPDH抗體(按11 000稀釋)孵育過夜，TBST沖洗3次，每次10 min。加入二抗(按15 000稀釋)室溫搖床孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min。ECL顯影，蛋白印記采用Image J軟件進行分析。

1.3pCDH-HPK1-puro慢病毒骨架質粒的構建以HPK1 cDNA為模板進行PCR。上游引物5’-TGACCTCCATAGAAGATTCTAGAATGGACGTCGTGGA CCC-3’，下游引物5’-GAGCGATCGCAGATCCTTGCG GCCGCTCATTCCTGGATGTAGA-3’， 產物大小為109 000 bp。反應體系參考KOD FX DNA聚合酶使用說明書。反應條件: 94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，共35個循環；68 ℃ 5 min，12 ℃保存。PCR產物采用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為電壓120 V、時間30 min；電泳后成像觀察，切膠回收，將PCR產物插入pCDH-puro質粒EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點之間，調節目的片段及質粒片段的酶切產物質量濃度至50 mg/L，按質量比51于16 ℃連接，轉化熱激后，涂板倒置于37 ℃烘箱15 h。

1.4細胞培養MCF-7、293T、MCF10A細胞培養于含有體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，2 d傳代1次，待細胞進入對數生長期進行實驗。

1.5慢病毒包裝及轉染包裝：將慢病毒包裝質粒pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG、pCDH-HPK1-puro及pCDH-puro分別通過轉化擴大，使用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒。將293T細胞接種至10 cm細胞培養皿中，12 h后將pCDH-HPK1-puro(過表達組)或pCDH-puro(對照組)以及pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG按照質量比111共轉染293T細胞，8 h后換液，36 h后提取病毒液，1 500 r/min離心5 min后，取上清液采用0.45 μm濾頭過濾,4 ℃保存備用。24 h后可二次提取病毒液。

轉染:轉染前12 h將MCF-7細胞傳代，使細胞達到約40%融合。將2組(過表達組、對照組)病毒液分別轉染MCF-7細胞，并加入終質量濃度為5 mg/L聚凝胺，轉染8 h后，更換為正常培養基。第1次轉染24 h后可進行二次轉染。轉染3 d后，加入終質量濃度1 mg/L嘌呤霉素篩選3～5 d。

1.6正常乳腺上皮MCF10A細胞及乳腺癌MCF-7細胞HPK1蛋白表達水平的檢測采用Western blot法。實驗分為3組，即正常乳腺上皮細胞組(MCF10A組)和乳腺癌MCF-7細胞無轉染組(對照組)、HPK1轉染組(過表達組)，各組分別取5×106個細胞，培養過夜后，加入200 μL的RIPA蛋白裂解液提取細胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，半干法將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上，加入一抗(按11 000稀釋)，室溫下孵育2 h 后，TBST 洗膜，加入二抗(按12 000稀釋)，37 ℃反應1 h 后，ECL顯影，結果用Image J軟件進行分析。實驗重復3次。

1.7正常乳腺上皮MCF10A細胞及乳腺癌MCF-7細胞HPK1mRNA表達水平的檢測采用RT-PCR法。收集MCF10A組、對照組及過表達組細胞，計數后各組取5×105個細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。42 ℃ 2 min去除基因組DNA；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，進行反轉錄。以cDNA為模板，采用SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ進行PCR。反應條件: 95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，45個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCT法計算HPK1 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。引物序列及擴增產物大小見表1。

1.8對照組和過表達組MCF-7細胞增殖的檢測

采用MTT法。分別取對照組及過表達組對數生長期細胞接種在96孔板中，細胞密度為1×105mL-1，每孔加入100 μL的細胞懸液，培養過夜后，每組設3個復孔，37 ℃分別培養24、48、72、96 h，加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h后棄上清繼續培養4 h，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩混勻，于酶標儀波長450 nm 處測定各孔的吸光度值，計算2組細胞的增殖率：細胞增殖率=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

表1 引物序列及擴增產物大小

1.9對照組和過表達組MCF-7細胞凋亡及細胞周期的檢測分別取對照組及過表達組對數生長期細胞，經2.5 g/L胰蛋白酶處理后，1 500 r/min離心5 min收集細胞。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作步驟檢測細胞凋亡率；上流式細胞儀檢測細胞周期。每組均設3個復孔。

1.10統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白相對表達量的比較采用配對資料的t檢驗；對照組、MCF10A組、過表達組HPK1蛋白及mRNA相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；對照組及過表達組細胞凋亡率和細胞周期的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1乳腺癌組織和癌旁組織中HPK1蛋白的表達

結果見圖1。乳腺癌組織HPK1蛋白的相對表達量(0.194±0.019)低于癌旁組織(0.426±0.082)，差異有統計學意義(t配對=3.104，P=0.036)。

n：癌旁組織；c：癌組織。 圖1 4例典型患者乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白的表達

2.2pCDH-HPK1-puro載體構建結果PCR擴增結果(圖2)顯示條帶單一，亮度高，引物特異性強，提示載體構建成功。

M:Marker;1:HPK1。 圖2 PCR電泳圖

2.3對照組、MCF10A組、過表達組HPK1蛋白及mRNA相對表達量的比較結果見圖3、表2。與MCF10A組相比，對照組HPK1表達降低；與MCF10A組相比，過表達組HPK1表達增加。表明轉染成功，可進行后續實驗。

圖3 3組細胞Western blot結果

組別nHPK1蛋白HPK1mRNA對照組335.386±6.7250.980±0.032MCF10A組381.357±13.469*2.019±0.216*過表達組3187.642±23.426*#4.865±0.491*#F73.520125.800P<0.001<0.001

*：與對照組相比，P<0.05；#：與MCF10組相比，P<0.05。

2.4HPK1過表達對MCF-7細胞增殖的影響結果見圖4。由圖4可知，過表達組細胞增殖率低于對照組。

圖4 對照組和過表達組細胞生長曲線

2.5HPK1過表達對MCF-7細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果(表3)顯示，HPK1過表達可誘導細胞凋亡。

表3 對照組和過表達組MCF-7細胞凋亡率的比較 %

t=4.205,P=0.013。

2.6HPK1過表達對MCF-7細胞周期的影響結果見表4。

表4 對照組和過表達組MCF-7細胞周期的比較 %

3 討論

乳腺癌是全世界女性發病率最高的惡性腫瘤[1]，IDC-NOS是其最常見的病理類型。目前新輔助化療和靶向治療均取得較大進展，但是近處復發、遠處轉移以及化療藥、靶向藥物耐藥仍嚴重影響患者的生存質量，其生存期仍有待延長。因此，研究影響乳腺癌治療及預后的分子靶點具有重要臨床意義。

該研究首先在組織部分進行研究，發現HPK1在乳腺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織；然后通過Western blot、RT-PCR發現HPK1在乳腺癌MCF-7細胞中呈現低表達。為明確其可能機制，成功構建了HPK1過表達慢病毒并感染乳腺癌MCF-7細胞，以進一步探究HPK1過表達對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響。該研究結果表明， HPK1在乳腺癌細胞中低表達，HPK1過表達可抑制MCF-7細胞的增殖并誘導凋亡，使細胞周期阻斷在G0/G1期。總之，HPK1作為潛在基因靶點未來應用于乳腺癌的治療有一定的前景。

研究中作者發現HPK1在乳腺癌MCF-7細胞中表達低，且證明了HPK1過表達可抑制人乳腺癌細胞的增殖并誘導凋亡，將細胞周期阻斷在G0/G1期。該研究中，MTT法檢測結果顯示，HPK1過表達組48、72、96 h的細胞增殖能力明顯受到抑制；流式細胞分析發現，HPK1過表達組細胞凋亡率明顯增加，表明可誘導細胞凋亡。HPK1是MAP4K家族的重要成員之一，具有重要的生物學作用，其在多種惡性腫瘤中表達較低，且可能參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等。同樣，Li等[8]證明，HPK1可以抑制肺癌細胞的增殖、集落形成、遷移和浸潤等。Wang等[6]指出，胰腺癌細胞中的HPK1經蛋白酶介導降解后缺失，提示HPK1降解可能參與了胰腺癌的發生發展。Alzabin等[7]發現，HPK1是抑制前列腺素E2介導的抗腫瘤免疫反應的重要組成部分。此外，HPK1可以用于預測腫瘤進展或者復發[11-12]。由此可見，HPK1蛋白可能具有抗癌作用，上調其表達或增強其活性可能成為治療惡性腫瘤的重要手段[5]。

此外，張艷杰等[13]通過慢病毒表達載體使全長組織因子過表達。該研究構建了慢病毒pCDH-HPK1-puro重組載體，包裝病毒、轉染乳腺癌MCF-7細胞，成功獲得了HPK1過表達細胞；PCR基因擴增全長凝膠電泳以及Western blot、RT-PCR檢測過表達細胞中HPK1蛋白和mRNA的高表達都證明了載體構建的成功。同時，隨著技術進步，慢病毒包裝系統已經發展到第4代，具有更強的選擇性、穩定性和安全性[14]。因此，通過慢病毒包裝系統過表達HPK1是一種安全、穩定且成熟、有效的手段。

綜上所述，實驗建立了HPK1慢病毒穩定表達系統，在MCF-7細胞中成功過表達HPK1，并初步探討了HPK1對MCF-7細胞增殖、凋亡的影響，為后續研究HPK1過表達抑制乳腺癌的機制奠定了基礎，也為乳腺癌的治療提供了新方向。但HPK1抗癌的具體機制需要進行更深一步的研究。

[1] SIEGEL RL,MILLER KD,JEMAL A.Cancer statistics, 2017[J].CA Cancer J Clin,2017,67(1):7

[2] 丁顯飛,周學良,豆萌萌,等.哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的表達及其與乳腺癌預后關系的Meta分析[J].吉林大學學報(醫學版),2016,42(4):783

[3] LING P,YAO Z,MEYER CF,et al.Interaction of hematopoietic progenitor kinase 1 with adapter proteins Crk and CrkL leads to synergistic activation of c-Jun N-terminal kinase[J].Mol Cell Biol,1999,19(2):1359

[4] CHUANG HC,WANG X,TAN TH.MAP4K family kinases in immunity and inflammation[J].Adv Immunol,2016,129:277

[5] SAWASDIKOSOL S,ZHA R,YANG B,et al.HPK1 as a novel target for cancer immunotherapy[J].Immunol Res,2012,54(1/3):262

[6] WANG H,SONG X,LOGSDON C,et al.Proteasome-mediated degradation and functions of hematopoietic progenitor kinase 1 in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2009,69(3):1063

[7] ALZABIN S,PYARAJAN S,YEE H,et al.Hematopoietic progenitor kinase 1 is a critical component of prostaglandin E2-mediated suppression of the anti-tumor immune response[J].Cancer Immunol Immunother,2010,59(3):419

[8] LI Z,PARK HR,SHI Z,et al.Pro-oncogenic function of HIP-55/Drebrin-like (DBNL) through Ser269/Thr291-phospho-sensor motifs[J].Oncotarget,2014,5(10):3197

[9] WANG Y,LUO H,LI Y,et al.hsa-miR-96 up-regulates MAP4K1 and IRS1 and may function as a promising diagnostic marker in human bladder urothelial carcinomas[J].Mol Med Rep,2012,5(1):260

[10]王嬌嬌,宋麗杰,楊森,等.造血祖細胞激酶1在雌激素受體陽性乳腺癌中的表達及其與預后的關系[J].中華實驗外科雜志,2016,33(8):2022

[11]VAN DER HEIJDEN AG,MENGUAL L,LOZANO JJ,et al.A five-gene expression signature to predict progression in T1G3 bladder cancer[J].Eur J Cancer,2016,64:127

[12]LIN M,ZHANG Y,LI A,et al.High-throughput RNAi screening of human kinases identifies predictors of clinical outcome in colorectal cancer patients treated with oxaliplatin[J].Oncotarget,2015,6(18):16774

[13]張艷杰,武敏,蔣賢杰,等.慢病毒表達載體研究全長組織因子對乳腺癌的作用[J].蘭州大學學報(醫學版),2015,41(3):1

[14]孟凡榮,陳琛,萬海粟,等.慢病毒載體及其研究進展[J].中國肺癌雜志,2014,17(12):870

(2017-06-10收稿 責任編輯姜春霞)

Expression of HPK1 in breast carcinoma tissue and effects of HPK1 overexpression on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cell MCF-7

WANGJiaojiao1),FANZhirui2),LILifeng2,3),DINGXianfei2,4),ZHOUXueliang2),YANGZiyue4),YUANBo2,4),XUZhentao2,4),MABingjun5),ZHAOJie5),WANGLiuxing2)

1)DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofGeneralICU,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 5)DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

HPK1;overexpression;breast carcinoma;MCF-7 cell;proliferation;apoptosis

Aim: To detect the expression of hematopoietic progenitor kinase 1(HPK1) in carcinoma tissue of human invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified and breast carcinoma cells, and to investigate the effects of HPK1 overexpression on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cells by constructing HPK1 lentiviral vector. Methods: The expression level of HPK1 protein in carcinoma tissue and paired adjacent tissue from 48 cases of breast carcinoma was detected by Western blot. The expression level of HPK1 in MCF10A and MCF-7 cells was detected by Western blot and RT-PCR. The HPK1 sequence was amplified by PCR, lentivirus recombinant vector pCDH-HPK1-puro was constructed, virus was packaged and MCF-7 cells were transfected(overexpression group). The MCF-7 cells infected with empty vector virus was used as control group. The expression level of HPK1 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-PCR, respectively. The cell proliferation ability, cell apoptosis and cell cycle were detected by MTT assay and flow cytometry, respectively. Results: The expression level of HPK1 protein was lower in breast carcinoma tissue compared with adjacent tissue(P=0.036). The level of HPK1 protein and mRNA was lower in MCF-7 cells, compared with that of MCF10A cells(P<0.05). Compared with the control group, the expression level of HPK1 in the overexpression group was up-regulated, cell proliferation ability was decreased significantly, while the apoptosis rate and the proportion of G0/G1 were significantly increased(P<0.05). Conclusion: The expression of HPK1 in both breast carcinoma tissue and cell line is low, and overexpression of HPK1 could inhibit proliferation and induce apoptosis and block the cells in G0/G1 phase.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.005

*科技部科技惠民計劃專項基金資助項目 2013GS410101；河南省重大科技專項基金資助項目 151100310800

R737.9