腸道病毒71型熒光定量PCR方法的比較與評價*

趙伊珂，衛海燕，黃學勇，程寧寧，潘靜靜，王若琳，許汴利，郭萬申#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預防控制中心傳染病預防控制所 鄭州 450016

腸道病毒71型熒光定量PCR方法的比較與評價*

趙伊珂1)，衛海燕2)，黃學勇2)，程寧寧1)，潘靜靜2)，王若琳2)，許汴利2)，郭萬申1)#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預防控制中心傳染病預防控制所 鄭州 450016

腸道病毒71型；熒光定量PCR；TaqMan 探針

目的：定量檢測腸道病毒71型(EV71)臨床標本中病毒拷貝數,評價3種商業化TaqMan探針熒光定量PCR方法。方法將VP1全序連接到克隆質粒pMAL-c2X上，純化的質粒作為標準品。選取河南開封手足口病監測試點的105份手足口病患兒糞便標本，分別應用bioPerfectus Technologies(方法A)、KINGHAWK(方法B)和Beijing ABT(方法C)公司的熒光定量PCR方法進行檢測，比較EV71陽性檢出率和定量分析結果的差異，分析3種方法的一致性。結果成功構建重組質粒并繪制標準曲線，方程為Y=-3.35X+47.49；分別用方法A、B、C對105份標本進行檢測，EV71陽性檢出率分別為41.90%(44/105)、42.86%(45/105)和41.90%(44/105)，差異無統計學意義(P=0.987)；CT值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，差異有統計學意義(P<0.001)，方法C測得的CT值小于方法A和B(P<0.05)；3種方法最低檢測限值分別為102、10和102拷貝，靈敏度分別為93.62%、95.74%和93.62%，特異度分別為100.00%、75.00%和100.00%；一致性分析結果顯示，3種方法一致性較差。結論商業化的EV71熒光定量PCR試劑盒適用于定性檢測臨床標本，定量檢測EV71方法需要進一步研究。

自20世紀70年代初首次報道手足口病與腸道病毒71型(EV71)感染有關以來，全球多個國家相繼報道了EV71相關手足口病的大規模爆發和流行情況[1-3]。報道[4]顯示EV71感染是重癥手足口病患者發病的主要危險因素，因此，及時、快速、準確檢測EV71病毒對于治療手足口病和保護高危人群至關重要。雖然熒光定量PCR方法檢測EV71的分子診斷技術已經得到大力發展[5]，但目前實驗室使用的診斷方法良莠不齊。該研究采用3種商業化TaqMan探針熒光定量PCR方法，即bioPerfectus Technologies(方法A)、KINGHAWK(方法B)和Beijing ABT(方法C)3個公司的EV71熒光定量PCR方法檢測臨床標本和毒株，通過定性和定量比較，系統評價3種商業化熒光定量PCR試劑盒，為研究人員選擇定量方法提供參考意見。

1 材料與方法

1.1標本、毒株、細胞及載體2016年于河南開封監測試點收集的105份手足口病患兒糞便標本，年齡均小于3歲；毒株：EV71，柯薩奇病毒A組(CA)4、5、6、10、16，柯薩奇病毒B組(CB)2、5，埃可病毒6(ECHO6)，河南省疾病預防控制中心分子實驗室保存；細胞：RDa細胞、Hep-2細胞、DH5α感受態細胞(Tiangen公司)；載體：pMAL-c2X(英國NEB公司)。

1.2儀器與試劑ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國生命技術公司)、PCR儀(德國Jena公司)、全自動核酸提取儀(蘇州天隆生物科技有限公司)、微量核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)、凝膠圖像分析儀(美國Syngene公司)等。病毒RNA/DNA提取試劑盒(蘇州天隆生物科技有限公司)、PCR產物純化試劑盒(Foregene公司)、一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)、質粒純化試劑盒4.0(TaKaRa公司)等。

1.3VP1全序克隆對河南省疾病預防控制中心分子實驗室保存的EV71毒株進行VP1全序(891 bp)擴增。引物序列如下。P3：5’-CGGGATCCAT GGGAGATAGGGTGGCAG-3’；P4：5’-CGCCTGCAGT TAAAGAGTGGTGATCGC-3’。P3含有BamH酶切位點，P4含有Pst1酶切位點。反應條件：95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物純化后與pMAL-c2X載體連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞。PCR初步鑒定后，重組質粒和PCR產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結果用DNAssist 2.2進行分析。

1.4標準曲線和最低檢測限值用質粒純化試劑盒提取克隆質粒后，用微量核酸蛋白測定儀測定質粒濃度和純度(測定3次，取平均值)，10倍倍比稀釋，測定3種熒光定量PCR方法檢測范圍，建立標準曲線。每次實驗平行做2孔。

1.5臨床標本前處理和檢測離心管中加1 g玻璃珠、10 mL PBS、1 mL氯仿、約2 g標本，振蕩20 min后，室溫1 500×g離心10 min，取上清液待用。提取病毒核酸：按照病毒RNA提取試劑盒說明書，在配套的全自動核酸提取儀上操作，提純產物-80 ℃保存待用。定量PCR：分別用3種方法進行熒光定量PCR檢測，觀察結果并記錄CT值，反應條件嚴格參照說明書，在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀上進行擴增和結果分析。測序：105份標本染毒RD細胞，盲傳2代后，進行RT-PCR擴增，產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。CA4、CA5、CA6、CA10、CA16、CB2、CB5、ECHO6毒株用RD和Hep-2細胞進行培養，培養產物PCR鑒定后，分別用3種熒光定量方法進行檢測，每次實驗平行做2孔，進行特異性評價。

1.6統計學處理采用 SAS 9.1和MedCalc 13.1進行統計學分析。不同組間EV71陽性率的比較采用χ2檢驗；不同組間EV71 CT值的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；一致性分析采用Altman-Bland法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1VP1全序克隆陽性克隆菌落(白斑)增菌培養后，提取質粒，鑒定克隆結果。重組質粒PCR產物電泳的條帶位置與EV71毒株擴增產物的條帶相同，為945 bp，證明質粒構建成功，見圖1。

1～3：分別為DNA Marker DL1000、重組質粒PCR產物、毒株擴增產物。 圖1 重組質粒電泳鑒定結果

2.2標準曲線微量核酸蛋白測定儀檢測到的質粒濃度為53.0 g/L，A(260 nm)/A(280 nm)等于1.84，10倍倍比稀釋后在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀上做標準曲線；標準曲線方程為Y=-3.35X+47.49,截距為3.35，決定系數R2=0.999，PCR擴增效率為98.83%，曲線具有較好的相關性且有較寬的線性范圍。

2.3臨床標本和毒株檢測結果用A、B、C 3種熒光定量方法分別檢測105份臨床標本，EV71陽性檢出率分別為41.90%(44/105)、42.86%(45/105)和41.90%(44/105)，差異無統計學意義(χ2=0.026,P=0.987)。

克隆質粒標準品10倍倍比稀釋檢測3種方法的檢測低限，方法B最靈敏。以測序結果為金標準(105份臨床標本處理后，PCR產物測序結果顯示47例為EV71)計算靈敏度，方法B最高；7例非EV71毒株用3種方法復孔檢測，得到特異度，方法B最低。見表1。

用3種方法檢測的105份臨床標本中，均為陽性的標本有44例。方法A、B和C檢測44份標本的CT值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，3組CT值比較，差異有統計學意義(F=119.120，P<0.001)；且方法A和方法B檢測的CT值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，方法A、B與方法C檢測的CT值比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

以 A方法為參考，A方法與B方法相比，2.27%(1/44)的點在95%一致性界限以外，差值的均值為-0.7；方法A與方法C相比，4.54%(2/44)的點在95%一致性界限以外，差值的均值為10.2。在一致性界限范圍內，方法A與方法B和C相比，差值的絕對值最大為3.80和13.74。方法A和B有較好的一致性，方法A和C一致性較差。

表1 3種方法定量檢測結果

3 討論

手足口病實驗室診斷的“金標準”[6]雖然是病毒分離，但由于其敏感性差、操作復雜、耗時長等缺點，核酸檢測逐漸取代病毒分離，成為手足口病病原學檢測新的“金標準”[7]。該實驗以高通量測序為金標準，對105份臨床標本進行檢測，發現3種方法真陽性率都超過90%，這與文獻[8-9]報道一致，表明3種方法進行定性檢測時靈敏度都非常高。手足口病病毒定量方法包括組織半數感染量測定法[10]、空斑形成單位法[11]和熒光定量PCR法，前兩種因操作復雜、結果不夠準確逐漸被取代，也有研究[9,12]對熒光定量PCR方法進行比較，但未做定量比較。該實驗用穩定表達的克隆質粒做標準品，對3種方法進行定量比較，均為陽性的44份標本CT值均值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，3組間比較，差異有統計學意義，且方法C檢測的CT值小于方法A和B。分析其原因，可能是由于方法C加樣量(6 μL)大于方法A和B(均為5 μL)，模板量影響了熒光信號進入指數增長階段的閾值;觀察擴增曲線發現，S曲線的平臺期出現情況分別為方法A>方法B>方法C,分析其原因，可能是由于方法A循環數大于方法B循環數和方法C循環數，擴增條件不同擴增曲線的形狀不一致；用3種方法檢測7份非EV71毒株時，方法B檢測CA4和CB2陽性，推測方法B的擴增過程中可能產生了非特異性的擴增，該方法需要針對特異性進行進一步的優化。

綜上所述，商業化的熒光定量PCR試劑盒可用于定性檢測EV71感染的手足口病臨床標本，而對于EV71病毒的定量檢測方法，則需要進一步改進和開發。

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[6] 手足口病預防控制指南：2008年版[J].中國鄉村醫藥,2009,16(S1):6

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(2016-12-28收稿 責任編輯姜春霞)

Comparison and evaluation of different fluorescent quantitative PCR methods for enterovirus 71

ZHAOYike1),WEIHaiyan2),HUANGXueyong2),CHENGNingning1),PANJingjing2),WANGRuolin2),XUBianli2),GUOWanshen1)

1)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

enterovirus 71; fluorescent quantitative PCR; TaqMan probe

Aim: To determine copy number of the enterovirus 71(EV71) in clinical specimens by quantitative analysis, and compare 3 commercial TaqMan fluorescence quantitative PCR methods systematically and comprehensively.Methods: VP1 sequence of EV71 was inserted into cloning vector pMAL-c2X. The purified plasmid was used as the standard sample for quantitative detection of 105 clinical specimens collected from the special monitoring system of HFMD in Henan Province. Positive rate and CT value among the 3 commercial TaqMan fluorescence quantitative PCR methods from bioPerfectus Technologies(method A), KINGHAWK(method B), and Beijing ABT(method C) were compared, and consistency was analyzed.Results: The recombinant plasmid pMAL-c2X was constructed successfully. Standard curve equation wasY=-3.35X+47.49.For 105 specimens, positive rate of EV71 measured by method A, B, and C was 41.90%(44/105), 42.86%(45/105), and 41.90%(44/105), respectively, and the difference was not significant(P=0.987). Among positive specimens, copy number by method C(14.17±3.19) was less than method A(24.34±3.92) and B(25.08±3.94), and the difference was significant(P<0.05). For 3 methods, the limit of detection was 102, 10, and 102copies; sensitivity was 93.62%, 95.74%, and 93.62%; specificity was 100.00%, 75.00%, and 100.00%. The result of 3 methods showed poor consistency.Conclusion: EV71 fluorescence quantitative PCR kit for commercialization is suitable for the qualitative detection of clinical samples; however, it needs further study for the quantitative detection of EV71.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.006

R373.2

*國家自然科學基金資助項目 81573204；河南省杰出青年資助項目 164100510008；河南省科技廳項目 122102310268

#通信作者,男，1966年4月生，本科，主任醫師，研究方向：流行病學，E-mail:cdcgws@163.com