針對癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長肽疫苗設計及其免疫活性檢測*

翟文杰，吳亞紅，韓艷林，李國棟，陳真真，杜江峰，祁元明，高艷鋒

鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

針對癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長肽疫苗設計及其免疫活性檢測*

翟文杰，吳亞紅，韓艷林，李國棟，陳真真，杜江峰，祁元明，高艷鋒#

鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

腫瘤免疫；癌睪抗原；表位預測；長肽

目的：設計針對癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長肽，并檢測其免疫活性。方法利用在線數據庫預測PLAC1、PL2L60、MAGE-3的CTL表位，在表位集中區域選取適當長度的長肽，化學合成并純化后，通過體外和體內活性實驗驗證長肽是否具有免疫活性。結果針對PLAC1、PL2L60、MAGE-3預測出HLA-A2限制性CTL表位并設計出7條長肽。體外自提呈、DC荷肽的ELISPOT結果和體外LDH結果顯示，PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175等4條長肽具有較好的免疫活性；體內ELISA結果顯示MAGE-3 P152-175在HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠中誘導了較多的IFN-γ釋放，體內LDH結果顯示PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175等4條長肽所誘導的HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠脾淋巴細胞對靶細胞具有較高的殺傷率。結論成功篩選鑒定出針對癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的4條長肽，可用作免疫治療疫苗。

腫瘤，特別是惡性腫瘤是影響人類健康和生存質量的重大疾病之一，治療腫瘤的方法有手術摘除、放療、化療及聯合治療等，雖然有一定的治愈率，但存在著術后復發率高或毒副作用強的問題。腫瘤免疫治療是通過激發和增強機體的免疫功能來控制和殺死腫瘤細胞[1]，具有特異性強和不良反應小的優點[2-3]。癌睪抗原作為腫瘤抗原可以引起細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應答而不會對正常細胞造成影響[4]，因此具有較高的研究價值，其中胎盤特異性基因1(placenta-specific 1，PLAC1)、生殖干細胞基因PIWIL2異化激活的產物之一PL2L60蛋白、黑色素瘤相關抗原3[5](melanoma-associated antigen 3，MAGE-3)是3種較為常見的癌睪抗原。多肽疫苗通常是指人工化學合成的腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原中的某一肽段。腫瘤多肽疫苗具有化學性質穩定、制作方便、無需細菌病毒等載體、腫瘤型別通用性強、有效率高、治療費用相對較低等優勢。使用軟件預測優勢抗原區域，篩選包含這個區域的長肽，這個長肽可能會在體內被抗原提呈細胞加工成多個CTL表位或者一些未知的MHC Ⅱ限制性CD4的輔助表位，同時也能克服短肽在體內降解較快的缺點，因而可能具有良好的抗腫瘤效果。作者選取3個癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3進行預測，并設計長20～25個氨基酸的長肽進行免疫活性實驗，以驗證所設計長肽的免疫效果，為多肽疫苗的應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1血液樣本、細胞株和實驗動物抽取3名HLA-A2志愿者的外周血，用于分離外周血單個核細胞(PBMCs)。T2A2細胞：轉染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細胞系，由第三軍醫大學吳玉章教授惠贈，用含體積分數10%胎牛血清的IMDM培養基在37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。靶細胞MCF-7：乳腺癌細胞系，經鑒定證實過表達PLAC1、PL2L60和MAGE-3，由實驗室常規培養及保存。小鼠：SPF級HLA-A2.1/Kb 轉基因小鼠，由第二軍醫大學曹雪濤教授惠贈，在IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具中飼養，選取8～12周齡的小鼠進行實驗。

1.2主要試劑和實驗器材IMDM干粉培養基(Gibco BRL公司)，RPMI 1640基質培養基(北京索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清(無噬菌體，杭州四季青公司)，CpG ODN-1826[生工生物工程(上海)股份有限公司]，DMSO、IFA、絲裂霉素C、LPS、人β2微球蛋白(Sigma公司)，紅細胞裂解液(北京曠博生物技術有限公司)，人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)，重組人IL-2、重組人IL-4、重組人IL-7、重組鼠IL-2、LDH細胞毒試劑盒(以色列ProSpec-Tany TechnoGene有限公司)，人IFN-γ ELISPOT檢測試劑盒、鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒(達科為生物技術有限公司)。SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，CO2孵育箱(日本三洋工業株式會社)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，酶標儀(美國熱電科技儀器有限公司)。

1.3 3種抗原的氨基酸序列及設計長肽的合成3種抗原的氨基酸序列全長由NCBI數據庫獲得，人源PLAC1氨基酸序列(212個氨基酸)，AAG22596.1；人源PL2L60序列(530個氨基酸)，ADV17663.1；人源MAGE-3氨基酸序列(314個氨基酸)，AAA17446.1。運用3個在線預測軟件SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)、NetCTL1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/)對3個抗原進行HLA-A2限制性CTL表位預測。根據集中的HLA-A2限制性CTL表位設計3個抗原來源的長肽，共獲得7條長肽，分別為：PLAC1 P42-64、PL2L60 P41-64、PL2L60 P169-191、PL2L60 271-293、MAGE3 P101-122、MAGE-3 P152-175和MAGE-3 P271-293。依據3種抗原設計的長肽由作者所在課題組采用標準Fmoc固相合成法合成，經反相高效液相色譜法純化，純度>95%，經電噴霧質譜法鑒定相對分子質量符合理論值。

1.4DC的誘導及成熟分離外周血獲得PBMCs，以含體積分數10%胎牛血清的IMDM培養基重懸，調整細胞密度為2×106mL-1，2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養6 h；抽取液體及未貼壁細胞，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，用體積分數10% DMSO﹢體積分數90%胎牛血清重懸，-80 ℃保存；每孔加入IMDM培養基2 mL，并加GM-CSF(100 μg/L)、IL-4(50 μg/L)，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中繼續培養，每2 d半量換液一次，并補加GM-CSF、IL-4；培養至第5天加入LPS(100 μg/L)，誘導DC成熟；48 h后收集細胞。

1.5體外肽特異性T淋巴細胞的誘導

1.5.1 自提呈實驗 將PBMCs用培養基重懸，調整細胞密度為1×106mL-1，每孔1 mL接種于24孔板，第2天加入1.3中制備的長肽20 mg/L，第3天加入IL-2(50 U/mL)、IL-7(10 μg/L)繼續培養。每2 d半量換液并補加IL-2。7 d后1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入新鮮的含體積分數10%胎牛血清的IMDM培養基，并補加IL-2、IL-7。共刺激3輪，之后繼續培養3 d，收集細胞進入后續實驗。

1.5.2 DC荷肽實驗 收集成熟DC，無血清IMDM培養基洗滌后重懸并調整細胞密度為(0.5～1.0)×106mL-1，加入1.3中制備的長肽20 mg/L，培養4 h；收集細胞，無血清IMDM培養基洗滌1次后重懸并調整細胞密度為(0.5～1.0)×106mL-1，加入50～100 μg的絲裂霉素C和20 mg/L長肽，培養1 h，無血清IMDM培養基洗滌1次，用含體積分數10%滅活胎牛血清的IMDM培養基重懸，調整細胞密度為2×105mL-1；復蘇之前凍存于-80 ℃冰箱的PBMCs，重懸、調整細胞密度為2×106mL-1，以荷肽的DC作為刺激細胞，各取0.5 mL加入24孔板，繼續培養；隔日添加IL-2(50 U/mL)，每3 d半量換液，并補加IL-2；培養7 d后收集細胞，同法以101的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養，進行第2輪刺激；共刺激3次，第3次刺激后的第3天收集細胞，用于后續活性實驗。

1.6小鼠體內肽特異性T淋巴細胞的誘導將20只8～12周齡HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠隨機分成5組，即PBS組、PLAC1 P42-64組、PL2L60 P169-191組、MAGE-3 P101-122組及MAGE-3 P152-175組，每組4只，每只小鼠每次注射100 μL以下試劑，PBS組給予30 μg CpG ODN-1826+50 μL PBS(pH 7.2)+50 μL IFA；其他4組分別以50 μL 2 g/L相應長肽代替PBS，其余同PBS組。分別在第0、6和13天在小鼠尾根部皮下進行3次免疫注射，并記錄小鼠體重。第20天處死小鼠制備效應細胞：無菌條件下摘取脾臟，200目篩網研磨獲取脾細胞，轉移至滅菌離心管中，900 r/min離心9 min，棄上清液后加入1 mL紅細胞裂解液(10×)，混勻，4 ℃裂解紅細胞10 min；900 r/min離心9 min，棄上清液，收集細胞，PBS(pH 7.2)洗滌2次；用10 mL含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸脾細胞，每孔5 mL接種于6孔板；第2天每孔加入250 U重組鼠源IL-2、CpG ODN-1826以及長肽；于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養6 d，收集細胞作為效應細胞，進行后續的ELISA和細胞毒活性(LDH)檢測。

1.7ELISPOT實驗按照作者所在的課題組常用的ELISPOT方法[6]，以1.5及1.6中誘導產生的CD8+T淋巴細胞作為效應細胞，調整細胞密度為2×106mL-1，每孔接種50 μL，每孔加10 μL長肽(1 g/L)作為刺激物，采用IFN-γ ELISPOT檢測試劑盒檢測分泌IFN-γ的T淋巴細胞數。

1.8LDH實驗按照作者所在的課題組常用的LDH法[6-7]進行檢測。以1.5及1.6實驗中誘導產生的CD8+T淋巴細胞作為效應細胞，MCF-7或荷載表位肽的T2A2細胞為靶細胞，效靶比分別為12.51、251和501，記錄殺傷率。

1.9ELISA法檢測體內肽誘導的T淋巴細胞分泌的IFN-γ量轉基因小鼠脫頸處死前摘眼球取血，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心30 min，取上層血清，ELISA法檢測IFN-γ，按照說明書操作。

1.10小鼠臟器指數取小鼠肝臟和腎臟，在電子天平上稱重，計算臟器指數。臟器指數=器官質量(mg)/小鼠體重(g)。

1.11數據統計采用SPSS 15.0處理數據。采用單因素方差分析比較7組間自提呈實驗和DC荷肽實驗釋放IFN-γ的T淋巴細胞數、5組小鼠T淋巴細胞IFN-γ的釋放量、小鼠體重及肝腎指數的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，采用兩獨立樣本的t檢驗比較自提呈實驗和DC荷肽實驗釋放IFN-γ的T淋巴細胞數的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1長肽的設計結果見表1。

2.2體外ELISPOT實驗與PBS組相比，7條長肽均能誘導3個志愿者的PBMCs產生活化的分泌IFN-γ的T淋巴細胞，其中4條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175有更多的IFN-γ斑點，因此后續選這4條肽進行小鼠體內實驗。DC荷載長肽刺激PBMCs后，與PBS組相比，7條長肽同樣可以誘導更多的IFN-γ產生，同時發現，長肽在經DC荷載后，誘導特異性T淋巴細胞的能力得到增強。結果見表2。

表1 PLAC1、PL2L60和MAGE-A3抗原來源的長肽設計結果

表2 ELISPOT實驗檢測自提呈實驗與DC荷肽實驗中釋放IFN-γ的T淋巴細胞數(n=3)

#：與PBS組相比，P<0.05；*:與自提呈實驗組相比，P<0.05。

2.3體外LDH實驗結果見圖1。由圖1可知，隨著效靶比的增大，特異性殺傷率也在增大，其中ELISPOT結果較好的3條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122的殺傷率均在28%左右。

2.4體內LDH實驗以MCF-7為靶細胞，效應細胞為免疫小鼠經長肽誘導后的脾細胞，設置效靶比分別為12.51、251、501，結果顯示4條長肽誘導的效應細胞對靶細胞均有一定的殺傷率，其中，PL2L60 P169-191、MAGE-3 P152-175殺傷效果較好。見圖2上。以T2A2負載長肽中對應的短肽為靶細胞，以長肽誘導后的脾細胞為效應細胞，進行LDH實驗，結果顯示，效應細胞對荷肽的T2A2有殺傷作用，但其殺傷效果不如對靶細胞MCF-7的殺傷效果。在效靶比為501時，幾條肽的殺傷率在10%～20%。見圖2下。

2.5體內ELISA檢測IFN-γ的釋放量結果見表3，由表3可知，4條長肽免疫小鼠后均可誘導一定量的IFN-γ產生。

圖1 自提呈實驗中長肽誘導 的特異性CTL的體外LDH實驗結果

a、b:對應的靶細胞分別為T2A2-P108-116、T2A2-P112-120。 圖2 長肽誘導的特異性CTL的體內LDH實驗結果

F=20.997，P=0.003；*：與PBS組相比，P<0.05。

2.6小鼠生理指標檢測結果見表4。如表4所示，5組差異無統計學意義，肝腎指數均在正常范圍內。

表4 長肽疫苗對轉基因小鼠體重及肝腎指數的影響(n=4)

3 討論

多肽疫苗作為一種很有潛力的腫瘤疫苗已經應用于各種腫瘤的免疫治療中，并在原有誘導CTL的基礎上有了新的進展，多表現在增強多肽疫苗抗腫瘤效應的策略方面，如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯用，增加多肽的長度，克服HLA分子限制性等[6-9]。有文獻[10]報道，在Ⅱ期臨床試驗中，篩選出的10條橫跨WT-p53蛋白70～248段序列、長度25～30個氨基酸的長肽經免疫注射給卵巢癌患者，顯示了較好的安全性和可接受性，并可以誘導特異性T淋巴細胞反應。同時發現一些重疊肽在動物模型中具有使腫瘤消退的作用，在癌癥患者中亦顯示了較好的抗腫瘤免疫效應[11-13]。也有文獻[14]報道單個長肽即可有效刺激CD8+、CD4+T淋巴細胞的產生。

作者在預測CTL短肽的過程中發現，結合不同預測軟件打分結果篩選得到的較高分值的多肽，多集中在抗原的某一區域，因此，設計中盡量包含這些潛在CTL表位的長肽。這些長肽不能直接結合MHCⅠ分子，必須經過抗原提呈細胞的加工和提呈，這就在一定程度上避免了短肽引起的免疫耐受現象。該研究中，作者先篩選了3個腫瘤抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3，在此基礎上設計了7條長肽。在體外ELISPOT實驗里，用這7條長肽刺激PBMCs，均可誘導分泌IFN-γ的CTL，并且其中的4條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、 MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175優于另外3條長肽。隨后的LDH實驗也證明，這4條肽對靶細胞MCF-7的殺傷率在效靶比為501時可達到30%左右。

研究中考慮到長肽被抗原提呈細胞加工和處理，作者設計了與自提呈實驗相應的DC荷肽實驗，即從PBMCs里分離出DC并誘導其成熟，讓DC荷載長肽，再進行ELISPOT實驗。結果顯示，長肽經DC的加工與提呈后，誘導了更多分泌IFN-γ的CTL。這可能有兩方面的機制：①自然狀態下DC僅占外周血PBMCs的1%，自提呈實驗里長肽被加工和提呈的效果不如DC荷肽實驗。②成熟DC高表達MHCⅠ/Ⅱ分子和免疫共刺激分子，長肽可能會被加工成Th輔助表位，誘導CD4+T淋巴細胞。CD4+T淋巴細胞可輔助CD8+T淋巴細胞的活化，后者分泌IL-2、IFN-γ，維持免疫記憶，也有一定的直接殺傷腫瘤細胞的作用。但該研究只檢測了分泌IFN-γ的T淋巴細胞，并未具體檢測是否有CD4+T淋巴細胞的存在，這也是實驗需要改進的地方。體內免疫活性實驗結果顯示4條長肽均可誘導特異性CTL的產生，其中一條肽MAGE-3 P152-175對靶細胞的殺傷率也達到30%，另外3條肽對靶細胞的殺傷率在20%～30%。隨后對小鼠的體重及肝、腎指數的分析顯示長肽免疫制劑對小鼠并無毒性作用。

綜上所述，來源于癌睪抗原的長肽疫苗能夠在體內外被抗原提呈細胞加工和提呈，可以誘導特異性CTL并對靶細胞有殺傷作用，所設計的長肽作為一種免疫治療疫苗具有較好的研究價值。

[1] ALY HA.Cancer therapy and vaccination[J].J Immunol Methods,2012,382(1/2):1

[2] ROSENBERG SA,YANG JC,RESTIFO NP.Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines[J].Nat Med,2004,10(9):909

[3] MICHIELIN O,RUFER N,ROMERO P,et al.New developments in cancer immunotherapy[J].Rev Med Suisse,2008,4(158):1248

[4] 趙建強,何愛麗,張王剛,等.白血病相關抗原MLAA-34 HLA-A2+限制性CTL表位的預測及鑒定[J].西安交通大學學報(醫學版),2011,32(4):424

[5] 白雪娟,許紅民,王強,等.不同分化程度大腸癌組織中MAGE-3的表達[J].解放軍醫學雜志,2006,31(5):444

[6] WU ZY,GAO YF,WU YH,et al.Identification of a novel CD8+ T cell epitope derived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma[J].Scand J Immunol,2011,74(6):561

[7] 韓艷林,翟明霞,吳亞紅,等.腫瘤轉移相關基因1 HLA-A3限制性細胞毒性T淋巴細胞表位的預測與鑒定[J].鄭州大學學報(醫學版),2012,47(6):773

[8] FAURE F,MANTEGAZZA A,SADAKA C,et al.Long-lasting cross-presentation of tumor antigen in human DC[J].Eur J Immunol,2009,39(2):380

[9] WELTERS MJ,BIJKER MS,VAN DEN EEDEN SJ,et al.Multiple CD4 and CD8 T-cell activation parameters predict vaccine efficacy in vivo mediated by individual DC-activating agonists[J].Vaccine,2007,25(8):1379

[10]LEFFERS N,LAMBECK AJ,GOODEN MJ,et al.Immunization with a P53 synthetic long peptide vaccine induces P53-specific immune responses in ovarian cancer patients, a phase Ⅱ trial[J].Int J Cancer,2009,125(9):2104

[11]LEFFERS N,VERMEIJ R,HOOGEBOOM BN,et al.Long-term clinical and immunological effects of p53-SLP?vaccine in patients with ovarian cancer[J].Int J Cancer,2012,130(1):105

[12]DE VOS VAN STEENWIJK PJ,RAMWADHDOEBE TH,L?WIK MJ,et al.A placebo-controlled randomized HPV16 synthetic long-peptide vaccination study in women with high-grade cervical squamous intraepithelial lesions[J].Cancer Immunol Immunother,2012,61(9):1485

[13]SPEETJENS FM,KUPPEN PJ,WELTERS MJ,et al.Induction of p53-specific immunity by a p53 synthetic long peptide vaccine in patients treated for metastatic colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(3):1086

[14]TAKAHASHI N,OHKURI T,HOMMA S,et al.First clinical trial of cancer vaccine therapy with artificially synthesized helper/killer-hybrid epitope long peptide of MAGE-A4 cancer antigen[J].Cancer Sci,2012,103(1):150

(2016-11-11收稿 責任編輯徐春燕)

Design and immune activity detection of long peptide vaccine targeted at cancer-testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3

ZHAIWenjie,WUYahong,HANYanlin,LIGuodong,CHENZhenzhen,DUJiangfeng,QIYuanming,GAOYanfeng

SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

tumor immunity;cancer testis antigen;epitope prediction;long peptide

Aim: To design long peptides based on CTL epitope prediction for cancer testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3, and to study the immune activity of the long peptides. Methods: The CTL epitope of PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 were predicted using online databases, the long peptides with appropriate length in the epitope region was chosen, and then they were synthesized chemically and purified. Finallyinvitroandinvivoactivity experiments were used to verify if the long peptides had immune activity. Results: HLA-A2 restricted CTL epitopes for PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 were predicted, and 7 long peptides were designed. The autopresentation, long peptide-pulsed DC ELISPOT assay and LDH results showed that long peptides PLAC1 P42-64, PL2L60 P169-191, MAGE-3 P101-122 and MAGE-3 P152-175 had better immune activity; the ELISA resultsinvivoshowed that MAGE-3 P152-175 induced more IFN-γ release in HLA-A2.1/Kb transgenic mice,invivoLDH results showed that the spleen lymphocytes from HLA-A2.1/Kb transgenic mice induced by the long peptides PLAC1 P42-64, PL2L60 P169-191, MAGE-3 P101-122 and MAGE-3 P152-175 had higher killing rate on target cells. Conclusion: Four long peptides pointing to cancer testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 have been successfully identified, which could be used as immunotherapy vaccine in future.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.007

R73

#通信作者，男，1980年10月生，博士，教授，研究方向：抗腫瘤多肽藥物，E-mail：gaoyf@zzu.edu.cn

*國家自然科學基金資助項目 81373228；81601448；81571547