蘆丁對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

趙一燦，張麗華#，趙 文，魏 博，蔣友旭

1)鄭州大學第二附屬醫院心血管內科 鄭州 450014 2)鄭州大學藥學院臨床藥學教研室 鄭州 450001

蘆丁對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

趙一燦1)，張麗華1)#，趙 文2)#，魏 博2)，蔣友旭1)

1)鄭州大學第二附屬醫院心血管內科 鄭州 450014 2)鄭州大學藥學院臨床藥學教研室 鄭州 450001

蘆丁；氧化應激；缺血再灌注損傷；血紅素加氧酶-1；大鼠

目的：探討蘆丁對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法將雄性SD大鼠隨機分假手術組，缺血再灌注損傷模型組，蘆丁高(80 mg/kg)、中(40 mg/kg)、低劑量組(20 mg/kg)，共5組，每組10只。結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型，心肌缺血再灌注后超聲心動圖評估心功能，測定各組大鼠心肌梗死面積，酶標儀檢測血清及組織心肌酶生成量和氧化指標活性的變化，HE染色法觀察組織細胞形態，免疫印跡法檢測血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達。結果與模型組比較，蘆丁治療組大鼠左心室射血分數及左心室短軸縮短分數升高，心肌梗死面積減小，血清肌酸激酶同功酶、乳酸脫氫酶、谷草轉氨酶水平和丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽含量升高,心肌內HO-1表達增多(P均<0.05)。結論蘆丁可提高HO-1的表達、減少和清除氧自由基，起到保護心肌缺血再灌注損傷的作用。

隨著藥物溶栓療法、冠狀動脈旁路搭橋術、冠狀動脈內支架安置擴張術等冠脈血運重建技術的廣泛應用，為急性心肌梗死的治療提供了更多可靠的方法，但同時面臨的心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷問題仍然存在。MI/R損傷具有多因素復雜的機制，其中自由基、鈣超載、中性粒細胞浸潤等與MI/R損傷關系密切[1-2]。黃酮類化合物在植物界分布非常廣泛，具有多種生物活性，包括抗心肌缺血[3]、抑制血小板集聚、抗炎等作用；蘆丁又名蕓香苷，是黃酮類化合物代表之一，目前對于蘆丁對抗MI/R損傷的作用機制方面研究較少。該研究通過運用動物模型探討蘆丁大鼠MI/R損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑與儀器雄性SD大鼠，SPF級，體重200～250 g，7～8周齡，購于鄭州大學實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)2010-0002，在(25±2)℃的環境溫度下飼養，光照條件(12 h/12 h)，自由飲食飲水。蘆丁(純度>98%)，購于上海阿拉丁化學有限公司。肌酸激酶同工酶(isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購于南京生物技術研究所。MS-250型小動物超聲儀(FUJIFILM VisualSonics公司)，DW3000-B型小動物呼吸機(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)，心電圖機(中國成都，RM6240多導生理信號采集處理系統)，HH-W600型恒溫水浴箱(金壇市醫療儀器廠)，TDZ5-WS型高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，凝膠成像分析儀(Protein Simple)，DYCZ-40D型轉膜電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2動物分組和處理采用隨機數字表法將雄性SD大鼠分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注損傷模型組(MI/R組)、蘆丁高劑量組(RH組)、中劑量組(RM組)、低劑量組(RL組) 5組，每組10只。其中蘆丁高、中、低各劑量組動物于術前30 min分別按80、40或20 mg/kg將蘆丁溶于CMC-Na 進行灌胃，MI/R組和假手術組于術前30 min用5 g/L CMC-Na進行灌胃。

1.3大鼠MI/R損傷模型建立參照文獻[4-5]方法稍加改進，將大鼠稱重，戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定于手術臺上。行氣管切開，接動物呼吸機以潮氣量 2.5 mL/100 g，80次/min持續通氣進行輔助呼吸，大鼠四肢皮下接心電圖機電極，描記心電圖。胸部脫毛，在心臟搏動最明顯處斜向切開皮膚約 1.5 cm，并剪去胸肋上肌肉，暴露肋軟骨，于第4～5肋間用彎鉤止血鉗鈍性插入肋間，用擴胸器將肋骨撐開，暴露手術視野，以棉球向下推開左肺，剪開心包，用棉簽推開左心耳，充分暴露心臟。在左心耳下2.5～3 mm 處，用 6-0 帶線縫合針線穿過一小束心肌，硅膠管置于結扎線與血管之間，拉緊結扎線，使硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而致閉塞，亦便于切斷結扎線再通。結扎后左室壁局部變蒼白，局部室壁運動減弱，連續監測心電圖可見ST-T弓背抬高，提示結扎成功，缺血30 min后，松解結扎線，再灌注后缺血部位心肌顏色恢復，ST段回落，證實結扎血管再灌注成功，關胸后再灌注24 h。Sham組僅在左冠狀動脈前降支位置取同樣大小的針穿線而不結扎，其余方法均同MI/R組。在整個手術過程中，大鼠的體溫用加熱毯維持在37 ℃。

1.4觀測指標及方法

1.4.1 心電圖監測 冠脈結扎前開始連續檢測至結扎后30 min，記錄心電圖。觀察Ⅱ導聯T波、ST 段的變化。

1.4.2 超聲心動圖評估心臟功能 大鼠心肌缺血30 min再灌注24 h后，對大鼠進行超聲檢查。探頭置于其左胸，在取得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后, 在乳頭肌水平將 M 型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得 M 型超聲心動圖，超聲系統自動計算左心室射血分數(EF)及左心室短軸縮短分數(FS)；每組原始數據取連續3個心動周期的平均值。

1.4.3 心肌梗死面積和梗死程度的測定 參照文獻[6-7]方法，再灌注24 h后取下心臟，-20 ℃冰凍10 min，在結扎線下平行于冠狀溝將左心室橫切5片，在TTC溶液37 ℃染色6 min后取出心臟，放入體積分數10%甲醛中固定。正常心肌組織呈磚紅色，梗死心肌組織不染色，以梗死區面積與左室總面積的比值來表示心肌梗死面積大小, 利用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統分析。

1.4.4 血清心肌酶譜和氧化應激相關指標的測定

心肌再灌注24 h后，所有的大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，-80 ℃保存，按照試劑盒說明書，應用酶標儀測定血清CK-MB、LDH、AST活性。應用試劑盒測定內源性抗過氧化酶的含量。

1.4.5 心肌組織形態學觀察 取左室心尖部組織體積分數10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，經各級乙醇漂洗，HE染色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察(200倍)。

1.4.6 血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白表達的免疫印跡法測定 參照文獻[8]進行免疫印跡分析。RIRA裂解心肌組織，提取總蛋白，應用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，各組取等量蛋白質(50 μg/孔)，完成SDS-PAGE后，進行電轉膜，再先后結合一抗和二抗，最后凝膠成像儀曝光。其中一抗HO-1和β-actin分別按11 000和12 500稀釋。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LDS-t檢驗比較各組大鼠心肌梗死面積、血清心肌酶活性(CK-MB、LDH、AST)、氧化應激相關指標(SOD、MDA和GSH)以及左心室EF、FS的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠心肌梗死面積的比較見圖1。Sham組大鼠心肌無梗死灶出現。大鼠缺血30 min再灌注24 h后，MI/R模型組大鼠的心肌梗死面積[(52.40±3.32)%]明顯增大。與MI/R模型組比較，蘆丁高、中、低給藥組可明顯縮小MI/R大鼠的心肌梗死面積[(20.35±1.16)%、(29.44±4.68)%、(38.33±2.78)%]，差異有統計學意義(F=138.176，P<0.001)。

圖1 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.2各組大鼠血清心肌酶活性的比較見表1。與Sham組比較，MI/R模型組大鼠血清 CK-MB、AST及 LDH活性均明顯上升(P<0.001)。與 MI/R 模型組比較，蘆丁各給藥組不同程度地降低 MI/R大鼠血清 CK-MB、AST 及LDH活性。

表1 各組大鼠血清CK-MB、LDH、AST的測定結果(n=6) U/L

#：與Sham組比較，P<0.01；△：與MI/R組比較，P<0.01。

2.3各組大鼠左心室功能的比較見圖2、表2。與Sham組比較，MI/R模型組大鼠左心室室壁運動明顯減弱， EF及FS明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)。與MI/R模型組比較，蘆丁給藥組左心室室壁運動相對增強，EF及FS顯著改善。

A：Sham組；B：MI/R組；C：RH組；D：RM組；E：RL組。 圖2 各組大鼠心臟超聲心動圖M超改變

#：與Sham組相比較，P<0.01；△：與MI/R組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠血清SOD活性、MDA、GSH含量的比較見表3。與Sham組比較，MI/R組大鼠血清SOD活性降低，血清MDA含量增加，GSH含量下降(P<0.01)。與MI/R模型組比較，蘆丁給藥組能降低血清MDA含量，增加血清GSH含量(P<0.05)。

2.5各組大鼠心肌組織的病理改變在顯微鏡下觀察各組心肌組織病理切片， Sham組大鼠心肌細胞形態學無改變，結構清晰，肌纖維排列整齊，細胞核長橢圓形，呈清藍色，心肌間質無炎細胞浸潤(圖3A)。MI/R組心肌間質血管擴張充血，纖維腫脹，心肌細胞空泡變性，大量炎細胞浸潤，呈纖維化改變，肌纖維排列明顯紊亂，局部橫紋不清或消失，肌纖維間隙增寬，可見大量心肌細胞溶解、壞死(圖3B)。與MI/R模型組比較， RH組的心肌細胞壞死明顯減少，心肌纖維可見輕度水腫，細胞核排列局部出現紊亂，心肌間質水腫，散在肌纖維肌漿聚(圖3C)；RM組組心肌間質灶狀出血，局部中性粒細胞浸潤，纖維肌漿凝聚深染(圖3D)；RL組心肌間質充血水腫，少量出血，偶見心肌細胞空泡變性(圖3E)。

表3 各組血清SOD活性、MDA、GSH含量的比較(n=6)

#：與Sham組比較，P<0.01；△：與MI/R組比較，P<0.05。

2.6各組大鼠心肌組織中HO-1的表達見圖4。與Sham組比較，MI/R組HO-1表達量明顯升高。與MI/R模型組比較，蘆丁給藥組(RH組、RM組)呈劑量依賴性誘導HO-1的表達。

A：Sham組；B：MI/R組；C：RH組；D：RM組；E：RL組。 圖3 各組大鼠心臟組織病理切片(HE,×200)

圖4 各組大鼠心臟組織HO-1的表達

3 討論

目前認為MI/R損傷的發病機制是多方面的，氧自由基增加和鈣超載是引起再灌注損傷的主要原因之一。心肌缺血時，由于心肌內源性氧自由基清除能力下降使氧自由基大量堆積，再灌注后分子氧重新進入心肌組織中，氧自由基水平急劇上升，導致細胞膜脂質過氧化，改變了膜脂的微環境和膜的通透性，心肌細胞膜逐漸滲透甚至破裂，進而導致血清心肌酶譜(CK-MB、LDH、AST)的升高[9-10]。SOD 是重要的內源性氧自由基清除劑，能降低脂質過氧化形成，從而保護細胞免受氧自由基的損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用；MDA 是脂質過氧化反應的最終代謝產物，能夠反映機體細胞膜受自由基攻擊的嚴重程度[11]；GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的小分子肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，廣泛分布于機體各器官內，它可通過巰基與體內自由基相結合而清除自由基，是體內重要的抗氧化物質。MI/R后由于氧自由基大量形成，細胞膜的結構和功能受到破壞，MDA含量升高；SOD與GSH活力/濃度下降，抗氧化能力減弱會加劇心肌細胞損害。HO是血紅素降解的起始酶和限速酶，可保持體內血紅素的平衡，HO-1是其誘導型。有研究[12-14]發現，MI/R后急劇增多的活性氧可誘導心肌細胞HO-1基因的表達，HO-1的表達又可上調細胞內過氧化氫酶和GSH水平而保護細胞免受氧化應激性損傷。

該研究證實，與Sham組相比，MI/R大鼠心功能降低，如EF和FS下降；MI/R大鼠血清中CK-MB、LDH、AST水平升高，血清中MDA含量的增加、SOD和GSH水平下降，表明再灌注后大量自由基產生引發脂質過氧化程度加重，產生大量MDA，同時使SOD及GSH消耗增多，減弱體內抗氧化防御系統；與MI/R組對比，蘆丁給藥組中血清MDA含量降低， GSH含量上調， LDH、CK-MB、AST活性降低，HO-1表達量明顯升高，且HO-1的表達與蘆丁劑量有關，表明蘆丁能夠呈劑量依賴性地減輕氧化應激反應，維持心肌細胞膜穩定性，對MI/R損傷起保護作用。

綜上所述，蘆丁能夠提高HO-1的表達，上調血清中SOD和GSH，從而減輕MI/R引起的氧化應激損傷，發揮心臟保護作用。這為探索蘆丁在抗缺血再灌注損傷的保護機制提供了實驗依據。

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(2016-12-07收稿 責任編輯趙秋民)

Cardioprotective effect of rutin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

ZHAOYican1),ZHANGLihua1),ZHAOWen2),WEIBo2),JIANGYouxu1)

1)DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofClinicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

rutin；oxidative stress；ischemia-reperfusion injury； heme oxygenase-1;rat

Aim: To investigate the cardioprotective effect of rutin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.Methods: Male SD rats were randomly allocated into Sham operation group, myocardial ischemia-reperfusion group(MI/R group),rutin high dose group(RH group,80 mg/kg), rutin middle dose group(RM group,40 mg/kg), and rutin low dose group(RL group,20 mg/kg)(n=10). Left anterior descending coronary artery was ligated to establish the myocardial ischemia-reperfusion injury model. Echocardiography evaluation of cardiac function after myocardial ischemia-reperfusion injury was performed. The area of myocardial infarction was determined. The myocardial enzymes(CK-MB, LDH, and AST) production and oxidation indexes(SOD, GSH and MDA) activity in serum and tissue were determined with enzyme-labeled instrument. The cell morphology was observed by HE staining. The expression of heme oxygenase-1 enzyme(HO-1) was detected by Western blot. Results: Compared with the MI/R group, EF and FS in the rutin groups were significantly increased, the area of myocardial infaction and myocardial enzymes were significantly decreased, the production MDA was significantly decreased, the activity of SOD and the production of GSH significantly increased, and the expression of HO-1 in the rutin groups was markedly increased(P<0.05). Conclusion: Rutin could increase HO-1 expression, therefore promote the endogenous antioxidant system against the myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.011

R541.4

#通信作者：張麗華，女，1964年3月生，碩士，主任醫師，教授，研究方向：冠心病的基礎與臨床，E-mail：zlhxp@126.com；趙文，女，1968年2月生，博士，教授，研究方向：心血管生理、病理生理及藥理學，E-mail：zhaowen100@139.com

*國家自然科學基金 81270270,81470524,81603114；教育部博士點博導專項基金 20134101110013；中國博士后科學基金 2016M592316