氧化石墨烯-二氧化鈦納米材料對吲哚菁綠穩定性及體內分布的影響

李文武，張曉戈，祝 杏，張慧娟#

1)河南省食品藥品評價中心 鄭州 450018 2)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

氧化石墨烯-二氧化鈦納米材料對吲哚菁綠穩定性及體內分布的影響

李文武1)，張曉戈2)，祝 杏2)，張慧娟2)#

1)河南省食品藥品評價中心 鄭州 450018 2)鄭州大學藥學院藥物分析教研室 鄭州 450001

吲哚菁綠；氧化石墨烯-二氧化鈦納米材料；紫外-可見吸收光譜；穩定性；體內分布

目的：研究氧化石墨烯-二氧化鈦納米材料(TiO2-GO)對吲哚菁綠(ICG)穩定性及體內分布的影響，探討TiO2-GO/ICG作為光敏劑應用于腫瘤治療的可能性。方法采用紫外-可見吸收光譜法，研究儲存時間及激光照射等因素對ICG 和TiO2-GO/ICG穩定性的影響；并以荷瘤小鼠為模型，靜脈注射后，利用小動物活體成像儀觀察TiO2-GO對 ICG 體內分布的影響。結果TiO2-GO可以有效增強ICG在常溫儲存以及近紅外激光照射下的穩定性；作為納米材料，TiO2-GO可顯著改善ICG在體內的分布，增強其在腫瘤部位的蓄積。結論TiO2-GO可通過增強ICG穩定性及腫瘤部位蓄積提高其光療效果。

光療包括光熱治療和光動力學治療(PDT)，作為一種新的腫瘤治療手段，具有選擇性強、毒副作用低以及非侵入性等優勢[1-2]。而在臨床應用中，近紅外光源(>780 nm)由于組織穿透能力強而被廣泛采用。吲哚菁綠(indocyanine green， ICG)，作為一種被美國食品藥品監督管理局(FDA) 批準用于臨床的近紅外醫學診斷試劑，在腫瘤光療應用中亦有較大潛力[3-5]。但ICG自身的一些缺陷會大大削弱其治療效果，如在水溶液中不穩定、光照易分解、體內會被快速清除、腫瘤靶向能力差等[6]。因而，如何提高ICG的穩定性，增加其在腫瘤部位的有效轉運是提高其腫瘤光療效率的關鍵[7-8]。作者用紫外-可見吸收光譜法研究了實驗室自制的氧化石墨烯-二氧化鈦納米材料(TiO2-GO)對ICG穩定性的影響，并用近紅外成像方法分析了納米制劑(TiO2-GO/ICG)對ICG體內分布行為的影響，以期為ICG在腫瘤光療領域的開發與應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1儀器與材料UV-2102紫外分光光度儀；PN156激光發射器(808 nm)；Ti27 Fluke 紅外熱成像照相機；FX PRO小動物活體成像儀; ICG購自上海金穗生物科技有限公司；TiO2-GO由鄭州大學藥學院藥物分析教研室合成；水為二次蒸餾水；所用試劑均為分析純。

1.2TiO2-GO/ICG的制備和表征稱取2.0 mg TiO2-GO，加入4.0 mL超純水，超聲使之分散，得0.5 g/L的TiO2-GO溶液。稱取1.0 mg ICG，加入2.0 mL上述TiO2-GO溶液，探超2 min(超聲時間5 s, 間隔3 s，超聲次數24次，功率100 W)，得0.5 g/L的TiO2-GO/ICG溶液，避光保存。采用紫外可見分光光度法對其進行表征。

1.3穩定性實驗

1.3.1 長期穩定性 將ICG和TiO2-GO/ICG水溶液常溫(25 ℃)避光保存7 d，在剛配制完以及第2、4和7天分別取出3 mL，檢測其紫外可見吸收光譜，考察TiO2-GO對ICG水溶液穩定性的影響。

1.3.2 光照穩定性 取ICG和TiO2-GO/ICG水溶液各20 mL于透明試劑瓶中，使用近紅外激光光源(808 nm，1.5 W/cm2)對樣品溶液進行處理，每次照射時間30 s，共照射3次。每次照射結束后檢測其吸收光譜，考察近紅外激光照射下TiO2-GO對ICG穩定性的影響。

1.4體內組織分布取(18～22) g BALB/c雌性小鼠，皮下接種4T1腫瘤細胞，等腫瘤長至100～150 mm3時，尾靜脈注射含ICG和TiO2-GO/ICG的PBS溶液(ICG：1.0 mg/kg)。給藥不同時間后，在720 nm激發波長和830 nm發射波長處進行活體成像處理，考察納米材料TiO2-GO對ICG在荷瘤小鼠體內的組織分布及腫瘤蓄積的影響。

2 結果

2.1TiO2-GO/ICG的表征見圖1、2。TiO2-GO納米材料(實驗室自制)具有較大的比表面積以及sp2雜化碳，可以作為一種優良的藥物載體。ICG結構含離域π鍵，通過π-π堆積作用可以很容易地負載到TiO2-GO納米載體上。從圖1可知，ICG在近紅外區有兩個很強的吸收峰，分別位于711 nm和777 nm處。負載于TiO2-GO上后，700～800 nm的吸收光譜發生了顯著的變化，證明ICG和TiO2-GO之間存在著較強的共軛作用，從而影響到了ICG分子的微觀結構。圖2表明TiO2-GO/ICG的電位為-40.5 mV，納米粒之間通過靜電斥力可以穩定的存在于水溶液中，良好的分散性是TiO2-GO/ICG體內應用的基礎。

圖1 ICG、TiO2-GO和 TiO2-GO/ICG的紫外可見吸收光譜圖

圖2 TiO2-GO和 TiO2-GO/ICG的Zeta電位分布

2.2ICG的穩定性見圖3。作為一種光敏劑，ICG的穩定性會較大程度的影響其光療效果。而通過納米載體負載或包封，可以顯著提高ICG的穩定性。從圖3A可知，游離的ICG水溶液在避光保存4 d時，ICG在777 nm的吸光度快速下降，到第7天時，ICG的光譜也發生了變化，證明游離的ICG分子在水溶液中不穩定，容易發生降解或結構破壞。圖3B表明ICG負載到TiO2-GO上后，常溫保存4 d吸光度降低很少，到第7天時吸收光譜亦未發生改變，證明TiO2-GO可以增強ICG在水溶液中的穩定性，顯著降低ICG的降解。圖3C顯示在808 nm激光第一次照射時，游離ICG的吸收光譜便發生了顯著改變，隨著照射次數的增多，ICG的特征峰消失，結構發生了嚴重破壞。而TiO2-GO/ICG組(圖3D)在激光照射下，除了吸光度降低一些以外，吸收光譜一直很穩定，沒有明顯的變化。

A：7 d內ICG水溶液吸收光譜的變化；B：7 d內TiO2-GO/ICG水溶液吸收光譜的變化；C： 808 nm激光照射下ICG水溶液吸收光譜的變化；D：808 nm激光照射下TiO2-GO/ICG水溶液吸收光譜的變化。 圖3 ICG的穩定性

2.3ICG的體內分布見圖4。由于ICG本身具有熒光，可直接用于小動物活體成像，可視化觀察其在荷瘤小鼠體內的分布。由圖4A和4B可知，給藥后0.5 h游離藥物(ICG組)主要分布于肝，到達腫瘤的量極少，給藥后藥物在體內代謝較快。負載于TiO2-GO上后，藥物(TiO2-GO/ICG組)在腫瘤部位的蓄積增加，且在體內的半衰期延長；給藥后8 h，在體內，特別是腫瘤部位，依然有較強的熒光。8 h后解剖小鼠，熒光強度統計結果(圖4C)顯示，TiO2-GO/ICG組腫瘤部位的熒光強度是ICG組的8.4倍。這說明納米材料TiO2-GO可以通過高滲透長滯留效應增加ICG在腫瘤部位的蓄積，同時由于與ICG的強共軛作用，可實現ICG在體內的緩慢釋放，延長其半衰期。

A：靜脈注射后不同時間ICG和TiO2-GO/ICG在4T1荷瘤小鼠活體內的分布；B：給藥8 h后，各個臟器內ICG的近紅外成像(a:TiO2-GO/ICG組，b：ICG組)；C：各個臟器熒光強度定量分析。 圖4 ICG的體內分布

3 討論

作為光敏劑，ICG的穩定性及體內分布代謝特征是決定其光療效果的關鍵因素。作者使用紫外可見吸收光譜法及小動物活體成像法分析了TiO2-GO納米材料對ICG穩定性及體內分布行為的影響。結果表明，TiO2-GO可顯著增強ICG在正常儲存及近紅外激光照射下其水溶液的穩定性，保護其結構不被降解或破壞。通過高滲透長滯留效應，TiO2-GO可增加ICG在4T1荷瘤小鼠腫瘤部位的靶向蓄積。二者之間的共軛作用亦可延緩ICG在體內的代謝速度。這些特性為ICG在腫瘤光療領域的開發與應用提供了新思路。

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(2016-12-01收稿 責任編輯趙秋民)

Influence of graphene oxide-titanium dioxide nanomaterial on the stability andinvivodistribution of indocyanine green

LIWenwu1),ZHANGXiaoge2),ZHUXing2),ZHANGHuijuan2)

1)FoodandDrugEvaluationCenterofHenanProvince,Zhengzhou450018 2)DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

indocyanine green；graphene oxide-titanium dioxide nanomaterial；UV-Vis absorption spectra；stability；invivodistribution

Aim: To investigate the influence of graphene oxide-titanium dioxide nanomaterial(TiO2-GO) on the stability andinvivodistribution of indocyanine green(ICG). To explore the possibility of TiO2-GO/ICG used for cancer treatment as a photosensitizer. Methods: UV-Vis absorption spectrum was used to evaluate the impact of storage time and laser irradiation on the stability of ICG and TiO2-GO/ICG. The effects of TiO2-GO oninvivodistribution of ICG were observed in 4T1 tumor-bearing mice by intravenous injection. Results: The results showed that TiO2-GO could enhance storage stability of ICG at room temperature and under near-infrared laser irradiation. As a nanomaterial, TiO2-GO could significantly improve theinvivodistribution of ICG and enhance its accumulation in the tumor. Conclusion: TiO2-GO can improve the phototherapy effect of ICG by enhancing its stability and tumor accumulation.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.012

R917

#通信作者，女，1986年1月生，博士，講師，研究方向：腫瘤靶向治療，E-mail：zhanghuijuan4@163.com