AAV9介導的CTRP9過表達對糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用*

肖明洋，劉淑珍，宋恒良，謝艷輝，萬大國#

1)鄭州大學第二附屬醫院心血管內科 鄭州 450014 2)鄭州大學第二附屬醫院急診科 鄭州 450014

AAV9介導的CTRP9過表達對糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用*

肖明洋1)，劉淑珍2)，宋恒良1)，謝艷輝1)，萬大國1)#

1)鄭州大學第二附屬醫院心血管內科 鄭州 450014 2)鄭州大學第二附屬醫院急診科 鄭州 450014

心肌纖維化；C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9；轉化生長因子β1/Smads信號通路；糖尿病；大鼠

目的：探討AAV9介導的CTRP9過表達對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用及其機制。方法45只6周齡健康SD大鼠分為對照組、GFP組和CTRP9組，每組15只。GFP組和CTRP9組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)造模,對照組腹腔注射生理鹽水；2周后,GFP組和CTRP9組分別經尾靜脈緩慢注射攜帶GFP和CTRP9基因的AAV9，對照組同法給予生理鹽水。轉染12周后檢測血糖及血清CTRP9水平,進行心肌Masson染色并計算膠原容積分數(CVF)以評價大鼠心肌纖維化程度,應用RT-PCR和Western blot分別檢測3組大鼠心肌TGF-β1/Smads通路中各因子mRNA和蛋白水平。結果轉染12周后，與GFP組相比，CTRP9組大鼠血清CTRP9上升，血糖降低，CVF也降低(P<0.05)；同時TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA表達水平降低，Smad7 mRNA表達水平升高(P<0.05)，α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達水平降低，Smad7蛋白表達升高(P<0.05)。結論AAV9介導的CTRP9過表達可能通過調節TGF-β1/Smads信號通路來抑制糖尿病大鼠的心肌纖維化。

糖尿病心肌纖維化是糖尿病常見的一種心臟病理變化,嚴重影響糖尿病患者的長期預后。心肌纖維化指心肌成纖維細胞在心肌細胞間質合成大量的膠原蛋白,并誘導其相互交聯聚合,使心室壁變硬、順應性下降,嚴重者可致心力衰竭。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9(CTRP9)是一種主要由心肌組織和脂肪組織分泌的細胞因子,與心血管活動密切相關,具有調節細胞代謝、穩定斑塊、改善胰島素抵抗和抗動脈粥樣硬化的作用[1-2]。既往研究[3-4]發現,TGF-β1/Smads通路激活是心肌發生纖維化的主要機制。體外研究[5]提示CTRP9可能具有抑制心肌纖維化的作用,并且可能與TGF-β1相關。9型腺相關病毒(AAV9)與體內心肌組織的親和性較高，多用作體內心肌轉染過表達目的基因的載體。因此，該研究利用鏈脲佐菌素(STZ)構建糖尿病心肌纖維化大鼠模型,以AAV9為載體轉染CTRP9基因,觀察CTRP9過表達對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑兔抗鼠α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗鼠p-Smad2/3多克隆抗體和羊抗鼠Smad7多克隆抗體均購自美國Abcam公司，TGF-β1、α-SMA、p-Smad2/3及Smad7二抗購自金斯瑞生物科技公司，Trizol試劑盒購自聯碩生物科技公司，質粒AAV9-mCMV-eGFP、菌株DH5α購自深圳百恩維生物科技有限公司，RT-PCR所用引物購自寧波康貝生化有限公司，CTRP9 ELISA試劑盒購自江萊生物科技公司。

1.2AAV9載體的構建與包裝于GenBank獲取大鼠CTRP9 mRNA序列，反轉錄為cDNA并進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒進行膠回收。將回收的CTRP9基因片段與腺病毒相關質粒AAV9-CTRP9-eGFP分別酶切，T4連接酶連接，再把產物轉化至DH5α菌株,篩選陽性克隆鑒定并測序,抽提質粒。將凍存的293T細胞復蘇并傳代培養24 h,細胞密度達80%～90%時，將AAV9-CTRP9-eGFP和輔助包裝質粒(AAV9 pHelper)加入到DMEM培養基中,共轉染293T細胞，轉染前更換培養液。同時以空載體和AAV9 pHelper共轉染293T細胞作為對照,48 h后收集上清液，2 400 r/min離心10 min,濾去細胞碎片,測定病毒滴度并于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3動物模型的制作與分組45只6周齡健康雄性SD大鼠，160～180 g,購自河南省實驗動物中心。隨機分為對照組、GFP組和CTRP9組,每組15只。禁食12 h后,GFP組和CTRP9組大鼠腹腔注射10 g/L STZ(60 mg/kg)構建糖尿病心肌纖維化模型[6]，對照組注射1 mL的生理鹽水。3 d后采用剪尾法測血糖,1次/d,連續2次,隨機血糖大于16.7 mmol/L則模型構建成功。2周后,CTRP9組和GFP組分別經尾靜脈緩慢注射AAV9-CTRP9和AAV9-eGFP(250 μL，滴度1×1012vg/mL)；對照組經尾靜脈注射250 μL的生理鹽水。轉染2周內對照組死亡1只，GFP組死亡1只，CTRP9組死亡2只。

1.4病毒轉染效率觀察病毒轉染4、8周后，每組分別處死1只大鼠,分離心室肌、OCT包埋、冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察心肌組織中的綠色熒光強度，評估病毒轉染情況。病毒轉染12周后，取處死大鼠的部分心室肌，同法測病毒轉染效率。

1.5血清CTRP9和血糖的測定轉染12周后經尾靜脈采血2 mL，靜置2 h后離心取血清，于-80 ℃冰箱保存，采用酶聯免疫法測定血清CTRP9。應用強生血糖儀剪尾法測血糖。

1.6病理觀察尾靜脈采血后，麻醉并處死大鼠，經胸骨正中切開取出心臟，分離心室肌，清洗并用濾紙吸干水分。沿左心室中線將心臟分為2部分，在心尖部取出厚度約2 mm的心肌，體積分數10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片，Masson染色并制成病理切片。在顯微鏡下(×400)可觀察到呈紅色的心肌纖維和呈藍色的膠原纖維，每張切片選取3個視野，使用Image Pro Plus軟件處理并計算心肌膠原容積分數(CVF)，CVF=膠原纖維面積/視野總面積×100%。

1.7RT-PCR法測定心肌組織中TGF-β1/Smads信號通路各因子mRNA的表達水平應用Trizol試劑盒提取大鼠心肌組織總RNA，反轉錄成cDNA并進行PCR擴增(引物序列見表1)。PCR反應體系：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸75 s，40個循環。按照2-ΔΔCt法計算出相對定量結果。

表1 引物序列

1.8Westernblot法測定心肌組織中TGF-β1/Smads信號通路各因子蛋白表達水平處死大鼠后收集心室肌標本并剪碎，RIPA裂解液裂解、勻漿，離心后獲得心肌組織總蛋白，應用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。將樣品進行PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，加一抗(α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7多克隆抗體)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，然后加二抗，室溫下孵育1.5 h，洗膜后顯影。應用凝膠成像系統處理圖像,將目的蛋白和內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.9統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。采用單因素方差分析比較3組大鼠血清CTRP9、血糖水平、CVF以及TGF-β1/Smads通路中各因子mRNA和蛋白表達水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠病毒體內轉染情況觀察病毒轉染4、8、12周，對照組無明顯熒光表達，GFP組和CTRP9組4周后即可觀察到微弱綠色熒光，8周后熒光強度明顯增強，12周后熒光強度較前下降。

2.2 3組大鼠血清CTRP9和血糖水平的比較與對照組相比，GFP組血糖升高；與GFP組相比，CTRP9組CTRP9水平上升，血糖下降，見表2。

2.3 3組大鼠心肌組織病理結果比較Masson染色顯示，對照組心肌間質中膠原纖維纖細，數量較少；GFP組心肌細胞排列紊亂，間質中粗大的膠原纖維顯著增多，CVF升高；與GFP組比較，CTRP9組心肌間質中膠原纖維較纖細，CVF降低。見圖1、表2。

2.4 3組大鼠心肌組織中TGF-β1/Smads信號通路各因子mRNA表達水平的比較與對照組比較，GFP組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達水平升高，Smad7 mRNA表達水平下降；CTRP9組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達水平較GFP組降低，Smad7 mRNA表達水平升高,見表3。

A:對照組；B:GFP組；C:CTRP9組。 圖1 3組大鼠心肌標本Masson染色(×400)

組別nρ(CTRP9)/(μg·L-1)c(血糖)/(mmol·L-1)CVF/%對照組12121.8±21.76.7±2.82.5±1.3GFP組12122.6±22.122.5±4.7*7.9±2.1*CTRP9組11146.2±22.5*#18.6±4.2*#5.0±1.9*#F4.46750.44228.205P0.019<0.001<0.001

*:與對照組比較,P<0.05;#:與GFP組比較,P<0.05。

表3 3組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達水平比較

*:與對照組比較,P<0.05；#:與GFP組比較,P<0.05。

2.5 3組大鼠心肌組織中TGF-β1/Smads信號通路各因子蛋白表達水平的比較與對照組比較，GFP組α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/3表達水平升高，Smad7蛋白表達水平下降；CTRP9組α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/3表達水平較GFP組下降，Smad7蛋白表達水平升高，見圖2、表4。

1～3:分別為對照組、GFP組和CTRP9組。 圖2 3組大鼠心肌組織中α-SMA、 TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7蛋白表達水平比較

組別nα-SMATGF-β1p-Smad2/3Smad7對照組120.55±0.110.42±0.210.53±0.240.82±0.14GFP組120.86±0.16*0.87±0.38*0.83±0.32*0.53±0.11*CTRP9組110.70±0.11*#0.58±0.27#0.58±0.27#0.68±0.15*#F16.2577.1523.90413.978P<0.0010.0030.030<0.001

*:與對照組比較,P<0.05；#:與GFP組比較,P<0.05。

3 討論

近年來,CTRPs在心肌纖維化發生中的作用引人關注。其中,脂肪因子CTRP3和CTRP6已經被證實可以通過抑制TGF-β1誘導Ras基因家族RhoA的活化,來進一步抑制心肌成纖維細胞分泌細胞外基質(ECM),減少膠原纖維的產生,最終抑制心肌梗死后的心肌纖維化[7-8]。CTRP9是一種主要由心肌組織和脂肪組織分泌的細胞因子,在心肌組織中高表達,與脂聯素受體1結合發揮信號轉導作用[9]。既往研究[2,10]發現CTRP9具有調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗、穩定斑塊和預防再灌注損傷的作用。體外動物實驗[5]顯示,輸注CTRP9蛋白可以有效改善小鼠心肌纖維化和恢復心臟舒縮功能。但既往研究均未明確CTRP9發揮抗心肌纖維化作用的具體機制。TGF-β1/Smads通路的激活是包括糖尿病在內的許多因素導致心肌發生纖維化的主要途徑[3]。因此,該實驗以轉染攜帶CTRP9基因的AAV9為干預措施,通過觀察轉染小鼠心肌組織中TGF-β1/Smad通路相關因子的表達水平,來研究脂肪因子CTRP9抗心肌纖維化的作用及機制。

Sun等[5]的研究發現大鼠心肌梗死后血清CTRP9水平下降,補充外源性CTRP9可以抑制TGF-β1因子的活化,從而抑制心肌梗死后心肌纖維化的發生,證實CTRP9與心肌纖維化有關。該實驗Masson染色顯示糖尿病大鼠心肌纖維化水平上升，過表達CTRP9干預后,心肌纖維化程度下降。既往研究[3]顯示,包括糖尿病在內的諸多因素致心肌纖維化的關鍵在于TGF-β1/Smads傳導通路的激活。TGF-β1能夠誘導心肌成纖維細胞發生分化,使膠原纖維合成增多并大量沉積在細胞間質,最后形成心肌纖維化。Smads蛋白作為胞內信息轉導遞質將TGF-β1信息轉至細胞核內。TGF-β1受體分3型,其中Ⅰ型、Ⅱ型受體以二聚體形式存在,TGF-β1與Ⅱ型受體胞外段結合同時激活受體胞內段絲氨酸/蘇氨酸激酶,Ⅰ型受體與之結合并被活化,下游Smad2和Smad3蛋白表達上調并發生磷酸化,p-Smad2/3與Smad4結合成寡聚復合物并轉位進入胞核內,調控相應靶基因轉錄[11]。另一方面，Smad7起著負反饋調節的作用,其通過與TGF-β1競爭性地結合TGF-β1Ⅰ型受體抑制下游信號轉導。該實驗結果表明糖尿病心肌纖維化與TGF-β1/Smads通路激活密切相關，經CTRP9過表達干預后, TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA及TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達水平均明顯降低,Smad7 mRNA和蛋白水平明顯升高,這說明CTRP9可能通過調節TGF-β1/Smads信號通路發揮抗心肌纖維化的作用。

α-SMA是心肌成纖維細胞中微絲的結構蛋白，也是其特有的標志蛋白。心肌纖維化過程中，肌成纖維細胞生成膠原纖維并誘導其聚集，是機體分泌ECM最主要的效應細胞[12]。既往研究[13]表明，Smad7可以通過抑制Smad2、Smad3的磷酸化來降低α-SMA蛋白的表達，抑制心肌纖維化的發生。該實驗結果顯示，過表達CTRP9干預后α-SMA表達量下調，說明CTRP9可以通過抑制肌成纖維細胞來減少膠原纖維的產生，這同Masson染色結果一致。研究[4，14]表明，CTRP9還可能通過調節基質金屬蛋白酶-2(MMP2)和MMP9的活性，促進ECM降解，從而抑制心肌纖維化。

綜上所述，CTRP9可能通過調節TGF-β1/Smads傳導通路的活化抑制糖尿病心肌纖維化。然而目前發現還有其他機制影響心肌纖維化[15]，該研究僅從CTRP9調節TGF-β1/Smads傳導通路的角度來闡述其機制，該通路是否與其他通路存在相互作用目前仍不明確，未來需要多機制研究，從而為糖尿病心肌纖維化的治療提供依據。

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(2016-11-26收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of overexpression of CTRP9 mediated by AAV9 on myocardial fibrosis in diabetic rats

XIAOMingyang1)，LIUShuzhen2)，SONGHengliang1)，XIEYanhui1)，WANDaguo1)

1)DepartmentofCardiology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014 2)DepartmentofEmergency，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

myocardial fibrosis;C1q/TNF-related protein 9;transforming growth factor β1/Smads signal pathway;diabetes mellitus;rat

Aim: To investigate the effects of CTRP9 on myocardial fibrosis and the mechanism in diabetic rats. Methods: A total of 45 healthy SD rats were assigned into 3 groups: control group,GFP group and CTRP9 group,15 rats in each group. Streptozotocin at 60 mg/kg was intraperitoneally injected in rats of GFP group and CTRP9 group to make diabetic rat model, and normal saline was injected in control group. After 2 weeks, the GFP group and the CTRP9 group were infected with adeno-associated virus 9(AAV9) carrying GFP and CTRP9 gene through tail vein, respectively. Meanwhile control group was injected with normal saline. After 12 weeks, the blood glucose and serum CTRP9 were measured. Masson staining was used to assess myocardial fibrosis and to calculate the cardiac collagen volume fraction(CVF). RT-PCR and Western blot were amplied to detect the mRNA and protein levels of TGF-β1/Smads pathway- related factors in myocardial tissue of rats. Results: After 12 weeks, compared with GFP group, the level of CTRP9 increased and that of blood glucose as well as CVF decreased significantly in CTRP9 group(P<0.05), meanwhile, the mRNA expressions of TGF-β1, Smad2 and Smad3 and the protein levels of α-SMA, TGF-β1 and p-Smad2/3 were decreased significantly(P<0.05), and the mRNA and protein expressions of Smad7 were increased significantly(P<0.05). Conclusion: Overexpression of CTRP9 inhibits myocardial fibrosis by regulating the expression of TGF-β1/Smads signaling pathway in diabetic rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.013

R542.2

#通信作者，男，1965年7月生，碩士研究生，教授，研究方向：心內介入治療，E-mail:xiaomingyangvip@sina.com

*河南省醫學科技攻關計劃項目 201503094