EGCG和維生素E對孕前期鉛暴露仔鼠學習記憶能力的影響*

張曉歡，孫貝貝，尹延彥，葛惠娜，李文杰#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)新鄉醫學院基礎醫學院 河南新鄉 453003

EGCG和維生素E對孕前期鉛暴露仔鼠學習記憶能力的影響*

張曉歡1)，孫貝貝1)，尹延彥2)，葛惠娜1)，李文杰1)#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)新鄉醫學院基礎醫學院 河南新鄉 453003

EGCG；維生素E；孕前期鉛暴露；小鼠；學習記憶能力；抗氧化損傷

目的：探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和維生素E(VitE)對鉛暴露仔鼠學習記憶能力的影響。方法將健康SPF級昆明雌鼠隨機分為對照組(4只)和染毒組(20只)。染毒組飲2 g/L醋酸鉛溶液染毒21 d，對照組飲無鉛去離子水21 d。染毒結束后按雌雄比21合籠飼養。分娩后第21天，將染毒組所產仔鼠隨機分為7組，即生理鹽水組、玉米油組、EGCG干預組(3.0 mg/kg)、VitE干預組(30 IU/kg)、聯合干預1組(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg)、聯合干預2組(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg)、聯合干預3組(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg)，每組10只；隨機選取10只對照組雌鼠所產仔鼠作為正常對照組。正常對照組仔鼠飲無鉛去離子水，其余7組仔鼠灌胃相應試劑，共干預28 d。灌胃結束后，用Morris水迷宮測定小鼠學習記憶能力，用極譜儀測定小鼠血鉛含量，用氧化酶試劑盒測定海馬組織中SOD活性和MDA含量。結果與正常對照組相比，生理鹽水組和玉米油組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，血鉛含量升高，海馬組織中SOD活性降低，MDA含量增加(P<0.05)。與生理鹽水組和玉米油組相比，各干預組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，血鉛含量不同程度降低，聯合干預1、3組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。結論EGCG和VitE可能通過提高海馬組織中SOD活性，改善仔鼠的學習記憶能力，對鉛暴露仔鼠神經損傷有一定的保護作用。

鉛是一種環境中廣泛存在的重金屬污染物，應用于工業、交通等許多領域。鉛通過呼吸道、消化道進入人體后，主要累及神經、血液及造血、消化系統等。生長發育期的嬰幼兒由于血腦屏障發育不完全，解毒功能不完善，對鉛的神經毒性極其敏感[1-2]。越來越多的研究[3-4]表明，氧化應激是鉛神經毒性的重要機制。茶多酚是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚中主要的活性成分[5-6]，具有顯著的抗氧化、抗癌等生物活性[7]，能夠改善癡呆模型小鼠的學習記憶能力和認知功能[8]。維生素E(VitE)在體內外均有很強的抗氧化作用，研究[9]證實其可預防和改善化學誘導的AD模型鼠的學習記憶能力。已有研究[10-11]表明多種抗氧化劑之間存在相互作用，使得兩種或多種抗氧化劑的抗氧化效果要遠遠大于單一抗氧化劑的抗氧化效果。該文旨在探討EGCG聯合VitE對孕前期鉛暴露仔鼠的學習記憶能力損傷和氧化損傷的干預效果。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器醋酸鉛(洛陽市化學試劑廠)，EGCG(上海晶純試劑科技有限公司)，VitE(美國Sigma公司)，玉米油(中糧集團)。將醋酸鉛和EGCG溶于生理鹽水，VitE溶于玉米油。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物有限公司)，Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，HVE-50高壓滅菌用蒸汽鍋(日本Hirayama公司)，797 VA極譜儀(瑞士萬通)，680ELX-800型酶聯免疫檢測儀(美國伯樂公司)。

1.2動物模型的建立及實驗分組選取SPF級昆明小鼠36只，其中雌鼠24只，雄鼠12只，購自河南省實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(豫)2012-0007。將36只小鼠在屏障環境中進行飼養，溫度控制在18～22 ℃，濕度在50%～60%，晝夜周期為12 h。將雌鼠隨機分為對照組(4只)和染毒組(20只)，染毒組飲2 g/L醋酸鉛水溶液21 d，對照組飲無鉛去離子水21 d。21 d后，每日20:00按雌雄比21合籠，次日8:00檢查陰栓，陰栓不確定者做陰道涂片，確定受孕日期，孕鼠單籠飼養。染毒組仔鼠自出生第1至第21天通過乳汁染毒。仔鼠斷乳后，將染毒組同窩仔鼠按體重隨機分為7組，即生理鹽水組、玉米油組、EGCG干預組(3.0 mg/kg)、VitE干預組(30 IU/kg)、聯合干預1組(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg)、聯合干預2組(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg)、聯合干預3組(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg)，每組14只，分籠飼養，每天9:00灌胃相應試劑，連續灌胃28 d。對照組仔鼠隨機選取14只(正常對照組)自由飲去離子水，生理鹽水組灌胃等量的生理鹽水，玉米油組灌胃等量玉米油。

1.3仔鼠學習記憶能力的測定灌胃結束后，對仔鼠進行Morris水迷宮實驗，檢測仔鼠學習記憶能力。水迷宮主要由直徑130 cm、高80 cm黑色圓形水池構成，池內水深60 cm，水溫控制在(22±2) ℃。整個水池分為東南西北4個象限，在第三象限正中水下2 cm處設置直徑為15 cm的圓形隱藏平臺，實驗期間保持其位置不變。將帶有顯示系統的攝像機安裝在迷宮上方，運用監控軟件采集信息，同步記錄小鼠運動軌跡。實驗前一天，先將小鼠放入水中，自由游泳，適應周圍環境。訓練時，將小鼠從東、西、南、北不同象限池的中點放入水池開始計時，以小鼠找到平臺2 s終止記錄，此時間即為逃避潛伏期，訓練過程中設置記錄時間為60 s，若小鼠在此時間內找不到平臺，則潛伏期為60 s，此時則由實驗者將其放上平臺適應10 s。每只小鼠每天訓練4次，連續訓練5 d，記錄最后一次逃避潛伏期測定結果。最后一次訓練結束后的第二天撤除平臺，任選一個入水點將受試小鼠面向池壁放入池中，所有受試小鼠的入水點必須一致，記錄60 s內小鼠穿越平臺的次數，作為小鼠的空間記憶能力成績。實驗結束后每組仔鼠的數量均在10只以上，每組選取體重相差較小、出生日期相近的10只作為研究對象，記錄其相關指標的檢測結果。

1.4仔鼠血鉛含量的測定在水迷宮實驗結束后次日，對小鼠禁食，用水合氯醛進行麻醉，摘除眼球采集血液，置于含有抗凝劑的凍存管中。血液反復凍融后，取400 L加入2 mL混合酸(高氯酸與濃硝酸體積比為14)消化，然后用極譜儀測定血鉛含量。

1.5仔鼠海馬組織氧化應激水平的測定血樣采集完成后，立即斷頭處死小鼠，剝離腦組織，在冰上快速分離出海馬和皮層，用冰鹽水沖洗，濾紙拭干，于-80 ℃冰箱中保存備用。將海馬加入預冷的生理鹽水中研磨成10%的組織勻漿，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，以Bradford法測定蛋白含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，TBA法檢測MDA含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6統計學處理數據采用SPSS 21.0處理。8組仔鼠各指標的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 8組仔鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數的比較見表1。生理鹽水組和玉米油組逃避潛伏期長于對照組，穿越平臺次數少于正常對照組(P<0.05)。與生理鹽水組或玉米油組比較，各干預組逃避潛伏期降低，穿越平臺次數增加(P<0.05)，但各干預組間比較，差異并無統計學意義(P>0.05)。

2.2 8組仔鼠血鉛含量的比較見表1。生理鹽水組和玉米油組血鉛含量均高于正常對照組(P<0.05)。與生理鹽水組或玉米油組比較，EGCG干預組和聯合干預1、3組血鉛含量降低(P<0.05)，而VitE干預組與聯合干預2組的血鉛含量變化無統計學意義(P>0.05)。

2.3 8組仔鼠海馬組織中SOD、MDA含量的比較

見表1。與正常對照組相比，生理鹽水組、玉米油組SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。與生理鹽水組或玉米油組相比，EGCG干預組和VitE干預組二者變化無統計學意義；聯合干預1、3組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)；聯合干預1、3組SOD活性較兩個單獨干預組及聯合干預2組更高(P<0.05)。

表1 8組仔鼠學習記憶能力、血鉛和海馬中SOD、MDA含量的比較

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與生理鹽水組和玉米油組比較，P<0.05；△：與EGCG干預組比較，P<0.05； ▼：與VitE干預組和聯合干預2組比較，P<0.05。

3 討論

環境鉛暴露對不同的生命階段均會產生毒害作用，尤其是嬰幼兒。有研究[12]表明，兒童體內血鉛濃度每上升100 μg/L，智商平均下降1～3分。基于哺乳期是鉛神經毒性非常敏感的窗口期理論，作者建立了一個在孕前期對母鼠進行鉛暴露的模型，通過乳汁對仔鼠進行鉛暴露，觀察不同劑量的VitE和EGCG的干預效果。

研究結果顯示，與正常對照組相比，生理鹽水組、玉米油組血鉛含量升高, Morris水迷宮逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數減少；與生理鹽水組和玉米油組相比，各干預組逃避潛伏期縮短，聯合干預組穿越平臺次數增多, 血鉛含量下降但干預組之間相比，差異無統計學意義。這些研究結果提示孕前期母鼠的鉛暴露可以通過乳汁使仔鼠的學習記憶能力下降，EGCG可以降低仔鼠體內血鉛含量，而EGCG和VitE的干預可以拮抗鉛對仔鼠學習記憶能力的損害。

氧化應激是鉛神經毒性的重要機制。鉛可以誘導ROS的大量產生，抑制抗氧化酶活性，使機體內氧化-抗氧化失衡，導致機體氧化損傷[13]。SOD可以清除超氧陰離子自由基，對機體的氧化-抗氧化平衡起著至關重要的作用。SOD活性間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA含量又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。研究結果顯示，與正常對照組相比，生理鹽水組和玉米油組仔鼠海馬中SOD活性降低，MDA含量升高，這與其他研究[14-15]結果基本一致。與生理鹽水組、玉米油組相比，聯合干預1、3組SOD活性提高，MDA含量降低;而單獨干預組、聯合干預2組SOD活性和MDA含量無明顯差異。

總之，EGCG和VitE可以提高海馬組織中抗氧化酶的活性，改善鉛暴露仔鼠的學習記憶能力，對鉛暴露仔鼠神經損傷有一定的保護作用。

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(2016-12-01收稿 責任編輯王 曼)

Effects of EGCG combined with vitamin E on learning and memory ability of progestational lead-exposed newborn mice

ZHANGXiaohuan1)，SUNBeibei1)，YINYanyan2)，GEHuina1)，LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,PublicHealthCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)CollegeofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan,453003

epigallocatechin gallate;vitamin E;lead exposed during progestational;mouse;learning and memory ability;antioxidative injury

Aim: To investigate the effects of epigallocatechin gallate(EGCG) combined with vitamin E(VitE) on learning and memory ability and antioxidative damage in hippocampus of progestational lead-exposed newborn mice. Methods: A total of 20 healthy mice were exposed to 2 g/L lead acetate aqueous solution, and 4 mice were given lead-free deionized water for 21 days. After that, the female and male mice were fed in one cage with 21 ratio. At the 21th day after delivery, the offspring of lead-exposed female mice were divided into 7 groups randomly: physiological saline group, corn oil group, EGCG group(3.0 mg/kg), VitE group(30 IU/kg ), combination group Ⅰ(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg), combination group Ⅱ(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg), combination group Ⅲ(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg), and received corresponding intervention for 28 days,10 in each group;the offspring(n=10) of lead-free female mice were the normal control, and received lead-free deionized water for 28 days. After the intervention, the learning and memory ability of mice was measured by Morris water maze,the blood lead level was measured by voltammetry, and the activities of SOD and the concentration of MDA in hippocampus were measured by Oxidase Kit.Results: Compared with the normal control group, the escape latency of the physiological saline group and the corn oil group increased, the times across the platform decreased, the blood lead level and MDA concentration increased, and SOD activity decreased(P<0.05).Compared with the physiological saline group and the corn oil group, the escape latency of the 5 intervention groups dcreased, the times across the platform increased, the blood lead level reduced in different degree(P<0.05); the SOD activity of combination group Ⅰ and Ⅲ increased, and MDA concentration decreased(P<0.05).Conclusion: EGCG and VitE might improve the learning and memory ability of lead-exposed offspring mice through increasing the SOD activity in hippocampus, which could protect the lead-exposed offspring mice from nerve damage.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.014

R179

*國家自然科學基金資助項目 81172716

#通信作者，男，1958年11月生，博士，教授，研究方向：營養與相關疾病，E-mail:lwj@zzu.edu.cn