單側Ⅱ類牽引對成年大鼠顳下頜關節滑膜的影響*

楊宇虹,楊 揚,李茜茜,陳旻生,張志偉#

1)鄭州大學第一附屬醫院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學第二附屬醫院口腔科 鄭州 450014

單側Ⅱ類牽引對成年大鼠顳下頜關節滑膜的影響*

楊宇虹1),楊 揚1),李茜茜1),陳旻生2),張志偉2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學第二附屬醫院口腔科 鄭州 450014

牽引；顳下頜關節；滑膜；大鼠；白細胞介素-1β；血管內皮生長因子

目的：研究單側Ⅱ類牽引對成年大鼠牽引側顳下頜關節滑膜的影響。方法180只8周齡的SD雄性大鼠采用隨機數字表法分為3組：A組(實驗組)，在右下第一磨牙和右上切牙之間固定Ni-Ti拉簧，加力20 g，建立單側Ⅱ類牽引模型；B組(假手術組)，同A組固定拉簧，不加力；C組(空白組)，不固定拉簧。每組按時間點(第1、3、7、14、21、28天)處死大鼠，取右側關節雙板區的滑膜組織進行HE染色和IL-1β、VEGF免疫組化染色，觀察滑膜的組織學變化，檢測IL-1β、VEGF的表達，并分析A組滑膜的病理評分和IL-1β、VEGF表達量之間的關系。結果A組各時間點IL-1β和VEGF的表達均比相應時間點B組、C組高(P<0.001) 。相應時間點A組的病理評分與IL-1β、VEGF的表達呈正相關(r=0.912、0.930，P均<0.001) 。結論單側Ⅱ類牽引可引起顳下頜關節滑膜發生組織學改變，這種改變與滑膜組織IL-1β、VEGF的表達有關。

顳下頜關節(temporomandibular joint，TMJ)是全身關節中結構和功能最為復雜的關節之一，是口頜系統中的左右聯動關節, 兩側的關節在結構、功能和運動方面都對稱協調一致。有研究[1]表明，不當的正畸治療可能與顳下頜關節紊亂病(temporomandibular joint disorder，TMD)的發生存在某些關聯，而滑膜炎是正畸引起的TMD常見類型之一。滑膜是TMJ囊內功能性整體的一部分，主要覆蓋在雙板區的上下面，在維持關節功能方面有重要作用。IL-1β、VEGF是滑膜炎中常見的致炎因子，IL-1β可加重局部炎癥反應，破壞關節結構[2-3]；VEGF能維持炎癥狀態，促進炎癥發展，引起滑膜增生等[4]?？趦鹊牟粚ΨQ牽引可通過牙列將力傳遞至TMJ，成人TMJ代償能力低，改建緩慢有限，不對稱牽引對成熟TMJ滑膜會產生怎樣的影響，目前仍不明確。該研究旨在通過觀察滑膜的組織學改變及IL-1β、VEGF表達的變化，探討單側Ⅱ類牽引對成年大鼠牽引側TMJ滑膜的影響。

1 材料與方法

1.1材料和儀器Ni-Ti拉簧(北京圣碼特科技有限公司)，彈簧測力計(杭州奧杰醫療器械有限公司)，游標卡尺(桂林廣陸數字測控股份有限公司)，正畸專用0.25 mm結扎絲(杭州西湖生物材料有限公司)，牙科低速手機(桂林市啄木鳥醫療器械有限公司),兔抗鼠IL-1β一抗、兔抗鼠VEGF一抗(美國Abcam公司),SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2動物分組及處理8周齡的SPF級健康SD雄性大鼠180只[山東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(魯)20140007]，230～250 g。適應性喂養1周后，將大鼠采用隨機數字表法分為實驗組(A組)、假手術組(B組)、空白組(C組)，每組60只。再按時間點(第1、3、7、14、21、28天)將A、B、C組大鼠均分為6個亞組，每個亞組10只。

麻醉前對A組大鼠進行稱重，用新鮮配制的70 g/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠

翻正反射消失后，固定大鼠的頭部和四肢，用自制的牽拉鉤牽拉大鼠的口角，暴露其口腔視野，用牙科低速金剛砂車針在大鼠右側下頜的第一磨牙近中頰軸面角近齦緣處和上頜中切牙遠中頰軸面角近齦緣處磨出一深約0.2 mm的淺凹，正畸結扎絲從右側第一磨牙和第二磨牙鄰間隙穿過在淺溝里結扎連接Ni-Ti拉簧的一頭，用彈簧測力計在口內施加20 g力，并用游標卡尺測量拉簧拉伸的長度，Ni-Ti拉簧另一頭結扎固定在右上中切牙的淺溝里(圖1)。在左右上中切牙之間和右下磨牙之間用樹脂粘結劑粘結，防止牙移動而導致建模失敗。B組同A組，稱重、麻醉、固定大鼠，功能位連接固定Ni-Ti拉簧但不加力。C組只在右下第一磨牙及右上中切牙頰軸面角近齦緣處處制備淺凹，不連接Ni-Ti拉簧。每天定時給大鼠稱重，并檢查口內裝置，發現脫落立即重新加載。

圖1 單側Ⅱ類牽引動物模型 建立后大鼠正位(A)、側位(B)照

1.3取材分別于建模后第1、3、7、14、21、28天，處死各亞組的大鼠，取牽引側雙板區滑膜組織，置于體積分數4%中性甲醛溶液中常規固定。

1.4牽引側雙板區滑膜組織HE染色主要步驟如下：脫水透明、浸蠟、包埋、切片(矢狀面，5 μm)、漂片、烤片、脫蠟染色、分化漂洗、脫水和復染、脫水和透明、封片。

由專業醫師按以下病理等級標準在400倍鏡下讀片、評分[5-7]?；ひr里層數目：0分，1層；1分，2～層；2分，4～層；3分，5～層?；は聦友軘的浚?分，<5個/mm2；1分，5～個/mm2；2分，10～個/mm2；3分，15～個/mm2。滑膜下層炎細胞數：0分，<2個/mm2；1分，2～個/mm2；2分，10～個/mm2；3分，50～個/mm2。總病理評分為以上各評分值之和。

1.5牽引側雙板區滑膜組織IL-1β、VEGF免疫組化染色主要步驟如下：脫水透明、浸蠟、包埋、切片(矢狀面，5 μm)、漂片、烤片、脫蠟、抗原修復、血清封閉、加一抗、加二抗、加SABC、加顯色劑、復染、脫水、封片。

用Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析軟件對切片中IL-1β、VEGF染色強度進行分析，以牽引側雙板區被覆的滑膜組織為檢測對象，每張切片在400倍鏡下選取3個檢測部位，檢測每張切片的光密度值，結果取平均值，作為IL-1β、VEGF的相對表達量。

1.6統計學處理采用SPSS 19.0進行統計學處理。3組大鼠TMJ滑膜IL-1β和VEGF相對表達量的比較均采用3×6析因設計的方差分析；A組大鼠滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達量之間的關系采用Pearson積差相關進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1牽引側雙板區滑膜組織HE染色C組滑膜未發生任何改變。B組滑膜襯里層數目在第14、21天有增加，滑膜下層血管數目和炎細胞數先增加后降低，滑膜病理評分與C組比較稍升高。A組的滑膜襯里層數目、滑膜下層血管數目和炎細胞數先增加，后期逐漸減少。見圖2、表1～4。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖2 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜的變化(HE,×400)

組別n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C組100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00B組100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.20±0.400.10±0.300.00±0.00A組100.00±0.000.60±0.660.10±0.301.00±0.631.40±0.501.20±0.49

表2 各組大鼠TMJ滑膜下層血管數目比較

表3 各組大鼠TMJ滑膜下層炎細胞數比較

表4 各組大鼠TMJ滑膜病理評分比較

2.2牽引側雙板區滑膜組織IL-1β、VEGF免疫組化染色C組IL-1β、VEGF的表達無明顯改變，A組和B組IL-1β、VEGF的表達均先升高，達到一峰值后，又逐漸下降。A組和B組IL-1β、VEGF的表達均高于C組，A組IL-1β、VEGF的表達高于B組,差異均有統計學意義。見圖3，表5、6和圖4。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖3 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜IL-1β的表達(SABC，×400)

組別n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C組1032.54±4.3331.75±2.8832.85±4.7330.19±2.9230.96±4.5029.76±1.83B組1036.12±5.90*49.01±4.58*51.59±3.24*45.08±4.23*39.87±2.14*34.18±2.87*A組1079.05±5.60*#111.65±4.91*#126.91±2.68*#97.72±7.25*#84.87±6.00*#70.79±4.26*#

F組間=1 379.049，F時間=46.607，F交互=20.283，P均<0.001；*：與C組比較，P<0.001;#:與B組比較，P<0.001。

表6 各組大鼠TMJ滑膜VEGF表達的比較

F組間=535.985，F時間=39.452，F交互=26.672，P均<0.001；*：與C組比較，P<0.001;#:與B組比較，P<0.001。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖4 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜VEGF的表達(SABC，×400)

2.3A組大鼠TMJ滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達量的相關性分析A組大鼠TMJ滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達量均呈正相關(r=0.912、0.930，P均<0.001)。

3 討論

咬合、關節、神經肌肉是一個有機的整體，當施加單側牽引后，穩定的口頜系統肌鏈狀態發生改變，關節肌肉張力的變化直接影響盤-髁復合體在關節囊內的位置和功能，囊內的流體靜壓升高，持續的高壓狀態會不斷刺激關節腔面的滑膜細胞，使滑膜細胞的表型、代謝和分化等功能發生改變，即為了建立新的平衡，機械信號傳遞給滑膜細胞，從而使滑膜細胞將機械刺激信號傳遞至核內，轉化為特定細胞應答，促進各種細胞因子的釋放，如IL-1β、VEGF，這些細胞因子與關節各種病癥的產生有密切的關系[8]。

該研究結果顯示，在大鼠口內施加單側Ⅱ類牽引后，滑膜先發生了輕微的急性炎癥反應，主要表現為滑膜下層組織中血管數目增多，血管擴張明顯，有炎細胞浸潤。隨后出現滑膜固有層細胞增生，這可能與牽引使關節滑膜發生了慢性炎癥反應有關。隨著時間的逐漸推移，滑膜發生了相應的適應性改建，滑膜的炎癥反應逐漸消退。IL-1β和VEGF是滑膜組織中重要的細胞因子，該實驗中C組的滑膜組織中有IL-1β、VEGF的低水平表達。而A組大鼠在施加單側牽引后，關節的力學微環境發生改變，通過信號轉導，使IL-1β、VEGF超生理量表達。實驗初期，隨著滑膜炎癥反應程度增強，IL-1β、VEGF表達增強，在第7天達到頂峰，之后炎癥反應逐漸減輕，IL-1β、VEGF表達也隨之減少。說明單側牽引能引起滑膜一定程度的炎癥反應，且嚴重程度與IL-1β、VEGF表達呈正相關，提示IL-1β、VEGF在滑膜炎癥中有重要作用，這與吳慶亭等[9]的觀點相似。作者還發現，在一些IL-1β、VEGF高表達區域，血管數目較多，滑膜細胞增生現象常見。該研究結果顯示，單側牽引后，牽引側雙板區滑膜發生的變化依次為：炎癥、細胞和基質增生、改建。說明在牽引過程中，滑膜逐漸發生了適應、改建和修復，但最終能否完全恢復至初始狀態，關節的生理功能是否受到影響，尚待進一步的深入研究來證實。在B組，滑膜組織也表現出了輕微的炎癥反應，IL-1β、VEGF表達也有增加。說明B組雖未加力，但口內的裝置仍對滑膜產生了影響，可能是由于口內的拉簧裝置使其咀嚼方式發生了改變，進而影響了關節。

TMJ是穩定性和靈活性高度協調的關節，長時間被動過大張口使關節的力學環境適應能力失代償，會引起各種細胞因子的超表達，誘發關節的無菌性炎癥，破壞關節表面的滑膜組織。因此在該研究的造模過程中，牽拉大鼠口角時應注意大鼠的開口度和時間，使開口度<25 mm[10]，熟悉建模技術，縮減被動開口時間，盡可能減少非實驗因素對關節滑膜的不利影響。TMJ是一個左右聯動的關節，由于實驗的局限性，該研究只研究了牽引側滑膜的變化，而關于牽引對側的滑膜、不同力值的牽引和牽引去除后滑膜的變化仍需進一步的研究。

綜上所述，IL-1β、VEGF參與了滑膜的反應性變化過程，且這種反應性變化有一定的可逆性。

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(2017-02-16收稿 責任編輯姜春霞)

Effects of unilateral class Ⅱ traction on synovial membrane of temporomandibular joint in adult rats

YANGYuhong1),YANGYang1),LIXixi1),CHENMinsheng2),ZHANGZhiwei2)

1)DepartmentofOrthodontics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofStomatology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

traction;temporomandibular joint;synovial membrane;rat;IL-1β;VEGF

Aim: To study the effects of unilateral class Ⅱ traction on temporomandibular joint(TMJ) synovial membrane in adult rats.Methods: A total of 180 8-week-old male SD rats were randomly allocated into three groups:group A(experimental group),fixed Ni-Ti spring loaded about 20 grams between the first molar and the upper incisor of right;group B(sham operation group),fixed Ni-Ti spring but not loaded;group C(control group), fixed no spring. Rats of each group were sacrificed at the time points(the 1st,3rd,7th,14th,21st,28th day), then the right synovial tissue of double plate area was prepared,and HE staining and immunohistochemical staining were used to observe the histological changes of synovial tissue and detect the expressions of IL-1β and VEGF, respectively. The relationship between the pathological score and the expressions of IL-1β and VEGF in group A was analyzed.Results: The expressions of IL-1β and VEGF in group A at each time point were higher than those of group B and group C(P<0.001).There was a positive correlation between the pathological score and the expression of IL-1β or VEGF in group A(r=0.912, 0.930,P<0.001).Conclusion: Unilateral class Ⅱ traction could cause histological changes of TMJ synovial tissue.There is a positive correlation between the histological changes and the expression of IL-1β or VEGF.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.017

R783.5

#通信作者，女，1967年1月生，碩士，主任醫師，研究方向：口腔正畸，E-mail：Zdeyzzw@163.com

*河南省醫學科技攻關計劃項目 201503088