透明質(zhì)酸修飾的氧化石墨烯負載米托蒽醌載藥體系在乳腺癌模型裸鼠體內(nèi)的藥動學特征和組織分布*

賈 欣，馮倩華，張宛霞，李玉真，楊雪梅，杜 娟

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

透明質(zhì)酸修飾的氧化石墨烯負載米托蒽醌載藥體系在乳腺癌模型裸鼠體內(nèi)的藥動學特征和組織分布*

賈 欣，馮倩華，張宛霞，李玉真，楊雪梅，杜 娟#

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

米托蒽醌；透明質(zhì)酸；藥動學；組織分布；小鼠；MCF-7細胞

目的：考察透明質(zhì)酸(HA)修飾的氧化石墨烯(GO)負載米托蒽醌(MIT)載藥體系(MIT/HA-GO)在乳腺癌模型裸鼠體內(nèi)的藥動學特征和組織分布。方法建立MIT測定的高效液相色譜法。荷瘤小鼠由尾靜脈分別注射MIT、MIT/GO以及MIT/HA-GO，用上述方法檢測MIT濃度，分析其在小鼠體內(nèi)的藥動學特征及在心、肝、肺、腎、瘤等部位的分布情況。結(jié)果與MIT組相比，MIT/GO組及MIT/HA-GO組MIT的血循環(huán)時間均延長，且在心、肺、腎的AUC降低；MIT/GO及MIT/HA-GO在腫瘤組織的靶向效率分別為MIT的1.55和2.61倍。結(jié)論MIT/HA-GO載藥體系降低了MIT的全身毒副作用并提高了對腫瘤部位的靶向性。

米托蒽醌(mitoxantrone，MIT)為蒽醌類廣譜抗腫瘤藥物，與阿霉素結(jié)構(gòu)類似，可廣泛應(yīng)用于乳腺癌、原發(fā)性肝癌及惡性淋巴瘤的治療[1-3]。但該藥靜脈滴注后在體內(nèi)的半衰期短，同時具有較大的分布容積，可快速分布在心臟、骨髓、肺、腎中，且有長期全身毒副作用[4]。組織選擇性差及腫瘤細胞耐藥性限制了MIT在臨床上的應(yīng)用。針對該問題，研究者們將目光轉(zhuǎn)向了腫瘤靶向納米轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。納米(50～250 nm)載藥體系可利用實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)將藥物被動靶向到腫瘤組織中，并延長藥物血循環(huán)時間[5-6]。另外，研究[7]發(fā)現(xiàn)乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌等癌細胞表面高表達CD44受體，而天然黏多糖透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)作為CD44配體可與之特異性結(jié)合，通過CD44受體介導的內(nèi)吞作用被攝取到腫瘤細胞內(nèi)。故HA可作為一種主動靶頭修飾到納米載體上，從而提高腫瘤對納米載體的攝取率。作者采用氧化石墨烯(graphene oxide，GO)納米載體負載化療藥物MIT，然后在GO表面修飾上HA，制備得MIT/HA-GO。以荷人乳腺癌MCF-7細胞小鼠為模型，采用高效液相色譜法考察MIT/HA-GO在體內(nèi)的藥動學參數(shù)及組織分布情況。

1 材料與方法

1.1材料鹽酸MIT(北京益康思達科技有限公司)，GO(南京吉倉納米科技有限公司)，透明質(zhì)酸鈉(山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司)，MIT/HA-GO(自制)，甲醇(色譜純)、乙酸銨、磺基水楊酸、抗壞血酸、枸櫞酸鈉均購自天津市恒興化學試劑制造有限公司。MCF-7細胞株(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)；BALB/C裸鼠，SPF級，雌性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。JY 92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份公司)，Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2色譜條件Agilent1200高效液相色譜儀；色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇與0.2 mol/L 乙酸銨水溶液(pH 3)體積比4258；檢測波長：663 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL[8-9]。

1.3MCF-7荷瘤裸鼠模型的構(gòu)建和樣品預(yù)處理取BALB/C裸鼠，于右腋皮下注射MCF-7細胞(3×106mL-1，0.2 mL)。接種7～10 d后，腫瘤體積達到(100±20) mm3時，即認為MCF-7荷瘤裸鼠模型構(gòu)建成功。荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥(MIT，5 mg/kg)后進行眼眶靜脈叢采血。將采集的血樣置于含有肝素的離心管中，3 000 r/min離心5 min，分離血漿。取小鼠血漿0.5 mL，加入50 μL含50 g/L抗壞血酸的0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 3.0)后渦旋混合。脫頸處死小鼠后將各組織洗凈稱重，小鼠各個組織(心、肝、肺、腎、瘤)先用生理鹽水洗凈，用濾紙吸干后精密稱重組織樣品，按組織的重量(g)與生理鹽水、含50 g/L抗壞血酸的0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 3.0)以不同配比(肝、腎、瘤為120.2，肺為130.3，心為140.4)加入勻漿，制備成組織勻漿。然后每200 μL組織勻漿或血漿再加入50 μL磺基水楊酸和150 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液進行HPLC測定[10]。

1.4方法專屬性考察將空白血漿、空白血漿混合MIT溶液和1.3中制備的給藥后裸鼠血漿樣品按1.2色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜圖。

1.5標準曲線的建立及回收率、精密度考察取1.3中小鼠各組織勻漿，加入一定量的MIT標準品溶液，分別制成組織系列樣品，按照1.3項下處理進樣，測定MIT濃度，得到各組織的標準工作曲線。同時根據(jù)標準曲線范圍選取出高、中、低不同濃度的組織質(zhì)控樣品，考察各組織樣品的回收率、精密度。

1.6體內(nèi)藥動學和組織分布觀察將荷瘤裸鼠分為3組，每組6只，經(jīng)尾緣靜脈分別注射MIT溶液、MIT/GO和MIT/HA-GO，給藥劑量為5 mg/kg。在給藥后5、15、30 min及1、3、6、8、12、24 h取血樣和組織，按1.3項下處理，并通過標準曲線計算藥物濃度。將藥時曲線用PK Solver軟件擬合，計算藥動學參數(shù)及各組織AUC0-inf及MRTinf以及不同組織的靶向效率Te。

2 結(jié)果

2.1方法專屬性考察結(jié)果見圖1。如圖1所示，MIT保留時間約為5.8 min，MIT樣品峰與雜質(zhì)峰分離良好，藥物峰不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

A：空白血漿；B：空白血漿混合MIT溶液；C：給藥后裸鼠血漿樣品。 圖1 裸鼠血漿樣品色譜圖

2.2標準曲線繪制及回收率、精密度考察各組織標準曲線的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)見表1。在標準曲線范圍內(nèi)，方法的批內(nèi)、批間精密度RSD均小于3%，方法回收率為96.95%～101.74%，提取回收率為84.57%～93.80%，符合生物樣品分析要求。

表1 各組織的標準曲線

A：藥時曲線下面積；C：MIT的濃度。

2.3 3組藥動學參數(shù)和藥時曲線的比較用PK Solver軟件分析藥動學參數(shù)如表2所示。MIT和MIT/GO均符合二室模型，而MIT/HA-GO符合三室模型。MIT、MIT/GO、MIT/HA-GO的消除半衰期[t1/2(β)]分別為1.76、2.33、4.60 h，說明MIT/HA-GO腫瘤靶向制劑顯著延緩了MIT的消除速度。另外,與MIT比較，MIT/HA-GO的曲線下面積(AUC)增大，藥物體內(nèi)平均滯留時間(MRT)延長，清除率(CL)降低，說明MIT/HA-GO在不同程度上改善了MIT的體內(nèi)過程，提高了生物利用度。3組小鼠的體內(nèi)藥時曲線如圖2所示。研究結(jié)果表明，MIT/GO和MIT/HA-GO組各時間點的血藥濃度均提高，說明MIT/HA-GO給藥系統(tǒng)延長了藥物的血循環(huán)時間。

表2 各組給藥后MIT藥動學參數(shù)

Vc：表觀分布容積；t1/2(pi)：深室分布半衰期；t1/2(α)：淺室分布半衰期；t1/2(β)：消除半衰期；AUMC：統(tǒng)計矩時間曲線下面積。

圖2 3組血漿MIT的藥時曲線

2.4 3組MIT體內(nèi)組織分布狀況的比較3組小鼠各臟器藥物分布如圖3所示。利用PK Solver軟件得出各組織的AUC0-inf及MRTinf，見表3。結(jié)果表明，MIT/HA-GO組和MIT/GO組MIT的體內(nèi)分布特征發(fā)生了改變，在心、肺、腎的AUC顯著降低，在腫瘤組織的靶向效率(Te)分別為MIT組的1.55和2.61倍，說明該制劑可以有效降低MIT在臨床應(yīng)用中的心、肺、腎毒性，提高腫瘤組織靶向性。

圖3 各制劑MIT的組織分布

3 討論

MIT存在骨髓抑制、脫發(fā)等全身毒性，且腫瘤細胞易對其產(chǎn)生耐藥性，限制了其臨床應(yīng)用范圍。該研究中作者用GO負載MIT并用HA修飾，得到MIT/HA-GO，結(jié)果表明MIT/HA-GO可明顯改變MIT在小鼠體內(nèi)的藥動學特征：MIT的消除速度顯著放緩，藥物血循環(huán)時間延長，這些體內(nèi)過程的改善可能與HA-GO裝載的MIT可緩慢釋放以及載體系統(tǒng)在體內(nèi)滯留時間長有關(guān)[11-12]。

組織分布實驗中MIT游離藥物在各組織均有較大的分布容積，組織選擇性差。MIT/GO制劑有良好的腫瘤靶向性，這是由于GO等納米材料可通過高通透性和滯留效應(yīng)被動靶向滲透進入腫瘤組織，但同時也發(fā)現(xiàn)該制劑在肝組織有較多的分布，推測為該納米顆粒容易被肝巨噬細胞吞噬而滯留導致[13]。MIT/HA-GO制劑可在一定程度上降低肝臟吞噬并更多地分布于腫瘤組織，原因可能為HA配體作為主動靶頭與乳腺癌細胞表面高表達的CD44受體特異性結(jié)合，通過CD44受體介導的內(nèi)吞作用被癌細胞攝取[14]。

綜上所述，MIT/HA-GO作為一種有潛力的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)，可高效靶向腫瘤細胞，這為腫瘤的有效治療開拓了新的途徑。關(guān)于其在體內(nèi)的藥效學和安全性評價等需進一步研究。

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(2017-01-13收稿 責任編輯徐春燕)

Pharmacokinetic characteristics and tissue distribution of hyaluronic acid-modified mitoxantrone-loaded graphene oxide in MCF-7 tumor bearing mice

JIAXin,FENGQianhua,ZHANGWanxia,LIYuzhen,YANGXuemei,DUJuan

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

mitoxantrone;hyaluronic acid;pharmacokinetics;tissue distribution;mouse;MCF-7 cell

Aim: To investigate the pharmacokinetic characteristics and tissue distribution of hyaluronic acid(HA)-modified mitoxantrone(MIT)-loaded graphene oxide(GO) in the MCF-7 tumor bearing mice. Methods: The mice were injected with MIT, MIT/GO and MIT/HA-GO via tail vein, respectively. And the pharmacokinetics study and drug distrubution in major organs of the three different formulations were determined by HPLC.Results: Compared with MIT, MIT/GO and MIT/HA-GO possessed prolonged circulation features and decreased the AUC in heart, lung and kidney. And the tumor targeting efficiency of MIT/GO and MIT/HA-GO were 1.55 and 2.61 times as compared with that of MIT, respectively.Conclusion: The HA-mediated MIT-loaded GO decreases the systemic toxicity of MIT and increases the tumor targeting efficiency.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.019

R737.9

*國家自然科學基金資助項目 81202485，81273451

#通信作者，女，1969年11月生，碩士，副教授，研究方向：藥事管理學，E-mail：dujuan2004@zzu.edu.cn