不同促排卵與激素替代治療方案對人種植窗期子宮內膜LIF、IL-1β與整合素αVβ3表達的影響*

譚 麗,劉昕媛,楚喜英,盧 娜,項云改,宋玉霞,李朋粉

鄭州大學第二附屬醫院生殖中心 鄭州 450014

不同促排卵與激素替代治療方案對人種植窗期子宮內膜LIF、IL-1β與整合素αVβ3表達的影響*

譚 麗△,劉昕媛,楚喜英,盧 娜,項云改,宋玉霞,李朋粉

鄭州大學第二附屬醫院生殖中心 鄭州 450014

誘發排卵；控制性超促排卵；激素替代治療；子宮內膜容受性

目的：探討誘發排卵、控制性超促排卵(COH)、激素替代治療(HRT)方案對人種植窗期子宮內膜容受性的影響。方法選取60例取消移植的患者作為研究對象。20例為自然周期排卵，10例為誘發排卵，20例為COH方案，10例采用HRT方案。每個方案分別于排卵后第5、6天(D5、D6)采集半數研究對象的內膜，免疫組化SP法檢測LIF、IL-1β與整合素αVβ3蛋白的表達。結果相同方案的D5與D6內膜間比較，3種蛋白的表達量差異均無統計學意義(P>0.05)。誘發排卵組、COH組、HRT組3種蛋白在內膜中的相對表達量均低于自然周期組，其中誘發排卵組最低，HRT組高于COH組(P<0.05)。結論HRT方案對人種植窗期子宮內膜容受性的影響最小。

輔助生育技術已經問世三十余年，但是臨床妊娠率仍然偏低(30%～60%)[1]。輔助生育技術中所用的誘發排卵、控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)等方案可能會使患者體內的性激素超出生理水平，從而降低子宮內膜容受性，導致妊娠失敗。因此，近年來子宮內膜容受性成為生殖領域的研究熱點。胚胎著床是通過多種免疫因子、細胞因子、黏附分子等的調控來完成的[2]，例如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、整合素αVβ3等。多項研究[3-5]表明，上述因子在子宮內膜中的高表達時間與種植窗開放時間同步，因此可以認為其是子宮內膜容受性的標志物。該研究以LIF、IL-1β及整合素αVβ3為觀察指標，比較了誘發排卵方案、COH方案以及HRT方案對人種植窗期子宮內膜容受性的影響，為優化臨床用藥方案提供更加可靠的理論依據。

1 對象與方法

1.1研究對象納入標準：女方年齡22～30歲，基礎內分泌在正常范圍，月經周期規律(27～33 d)，不孕原因為輸卵管因素和(或)男方因素，近3個月內無宮腔操作史，未服用激素類藥物，術前簽署經倫理委員會批準的知情同意書。排除標準：陰超提示子宮內膜不均或息肉，采樣日內膜厚度<8 mm，宮腔積液、積血，子宮內膜異位癥與子宮腺肌病，女方染色體異常等疾病，標本送病檢結果異常，輸卵管造影或B超提示輸卵管積水。根據上述納入和排除標準，選取2014年6月至2015年12月于鄭州大學第二附屬醫院生殖中心經誘發排卵后因卵泡發育多而改行體外受精(invitrofertilization，IVF)/卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕，取卵后取消移植的患者；或經COH長方案促排卵后接受IVF/ICSI助孕，取卵后為預防卵巢過度刺激取消移植的患者；以及經HRT方案調節子宮內膜，但本周期取消凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)的患者(胚胎解凍后，因損傷無胚胎可移植或因患者社會原因而無法移植者)。以月經周期規律、排卵正常、未用任何藥物者為對照。

1.2試驗分組①對照(自然周期)：月經第10天開始連續陰超監測卵泡發育，排卵后第5、6天采集內膜，分別為自然周期D5組、自然周期D6組，每組各10例。② HRT：10例采用HRT方案。月經第2天開始口服雌二醇(E2)片4 mg/d，第8天加量至6 mg/d，第10天開始監測子宮內膜厚度，當內膜厚度≥8 mm時(月經第15～19天)加用黃體酮肌內注射80 mg/d，連續6 d，于加用黃體酮后第5、6天取子宮內膜，分別為HRT D5組、HRT D6組，每組各5例。③ COH：20例采用COH方案。黃體中期開始垂體降調節，皮下注射短效曲普瑞林(達必佳，輝林制藥)0.1 mg/d，7 d后減為0.05 mg/d，降調14 d后加用促性腺激素(gonadotrophin,Gn)，肌內注射FSH 150～225 IU/d，適時添加HMG，Gn總量不超過300 IU/d。當3個以上卵泡直徑≥18 mm時停用達必佳和Gn，并于當晚肌內注射HCG 10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌內注射黃體酮80 mg/d，直至樣本采集。于取卵后第5、6天取子宮內膜組織，分別為COH D5組、COH D6組，每組各10例。④誘發排卵：10例采用誘發排卵方案。月經第5 天開始肌內注射Gn(FSH或HMG)150 IU/d，靈活調整用量，一般不超過225 IU/d。當2個以上卵泡直徑達18 mm且出現LH峰時停用Gn，當晚肌內注射HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌內注射黃體酮60 mg/d，直至樣本采集。取卵后第5、6天取子宮內膜分別為誘發排卵D5組、誘發排卵D6組，每組5例。

1.3標本采集患者取截石位，常規外陰、陰道與宮頸消毒，探針探查宮腔，隨后用子宮內膜取樣器在宮腔中上段抽吸少量內膜組織，經無菌生理鹽水漂洗后，分成兩份，一份送病理檢查，一份用于LIF、IL-1β、整合素αVβ3 的檢測。

1.4子宮內膜組織中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的檢測子宮內膜組織標本取材后迅速固定于甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制成蠟塊，然后4 μm厚切片，進行SP法免疫組化染色，按試劑盒(美國Santa Gruz公司、武漢博士德生物工程有限公司)說明操作。依次二甲苯脫蠟，高至低濃度乙醇復水，抗原熱修復，滴加體積分數3% H2O2以消除內源性過氧化物酶活性，滴加正常山羊血清，封閉內源性生物素，滴加一抗及生物素標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，抗體稀釋度為1100)，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素液，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。用PBS代替一抗作陰性對照。胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。淺棕黃色、棕黃色、深棕黃色著色分別判定為弱陽性、陽性、強陽性。每張切片選擇5個高倍視野(×400)，采用Biosens Digital Imaging System v1.6測定細胞內陽性區積分光密度(integral optical density，IOD)值，計算5個視野的IOD平均值，用來表示目的蛋白的相對表達量。

1.5統計學處理采用SPSS 22.0處理數據。4個處理組間目的蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；同一處理D5組和D6組的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組間一般情況的比較8組內膜經病理檢查，均確定為分泌期內膜，未見特殊病理情況。8組年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH以及取樣日內膜厚度差異均無統計學意義，見表1。

表1 各組間一般情況的比較

2.2子宮內膜組織中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的表達情況3種蛋白均主要表達于子宮內膜的腔上皮與腺上皮細胞的胞漿中。在誘發排卵組與COH組中染色為淺棕黃色，呈弱陽性表達；在HRT組中染色為棕黃色，呈陽性表達；在自然周期組中染色為

表2 子宮內膜組織中LIF的相對表達量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

深棕黃色，呈強陽性表達。子宮內膜組織中3種蛋白表達的比較見表2～4。各處理方案D5和D6間比較，3種蛋白的相對表達量差異均無統計學意義(P<0.05)。3種蛋白的表達量為誘發排卵

表3 子宮內膜組織中IL-1β的相對表達量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

表4 子宮內膜組織中整合素αVβ3的相對表達量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

3 討論

3.1不同用藥方案對子宮內膜容受性的影響卵巢分泌的E2與孕酮(P)是調節子宮內膜發育的最基本因素。有學者[5]指出，排卵前適度的E2與排卵后P的黃體支持是內膜容受性建立的基礎，合適的E2/P比例及P持續影響的時間是關鍵所在。

誘發排卵方案是在早卵泡期就給予Gn進行促排卵。在大量激素作用下，體內E2在早期就開始遠遠超過生理水平，這使得卵泡期LH過高、內源性LH峰提前，相應的P含量也會提前升高，導致E2/P比例不當，因此會損傷子宮內膜容受性。

COH中，標準的GnRH-α長方案開始于超排卵之前，在前一月經周期的黃體中期即開始應用GnRH-α進行垂體降調節，抑制了LH峰的出現，改善了卵子的質量，因此對種植窗和子宮內膜容受性有所改善。黃荷鳳等[6-7]的研究結果顯示，經過GnRH-α預處理后行超排卵，黃金地鼠的子宮內膜種植窗期與自然周期基本相似；而未經其預處理的單一PMSG超排卵的黃金地鼠種植窗期與自然狀態差距明顯。這也說明COH(GnRH-α長方案)與單純超排卵相比，對于子宮內膜容受性的傷害更小。

HRT是模擬人的自然生理周期，使用雌孕激素序貫療法來調節子宮內膜厚度及形態，以達到開放種植窗的目的。此方案可使體內E2/P比例達到較適宜的水平，與超排卵及COH方案相比，更接近生理水平，避免了超高量的激素所產生的嚴重不良影響。但HRT中的激素水平可能仍會比自然周期稍高，在一定程度上影響子宮內膜容受性。

該研究結果顯示：誘發排卵組、COH組、HRT組子宮內膜組織中LIF、IL-1β及整合素αVβ3的相對表達量均低于自然周期組，且誘發排卵組最低，而HRT組高于COH組，說明這三種方案均會降低子宮內膜容受性，但HRT方案優于COH與誘發排卵，誘發排卵方案的不良影響最大。這一結果與其他學者們的研究[8-9]結果相同，更進一步驗證了此結論的可靠性。

3.2不同用藥方案對種植窗開放時間的影響多數研究[4-5]表明，在促排卵周期中，大量激素會導致種植窗開放時間較自然周期提前1～2 d。但HRT對其影響目前尚存在爭議，有些學者[10]認為HRT會使種植窗延遲，另有學者[11]認為它不會對種植窗開放時間產生明顯影響。

該研究對各方案的D5與D6內膜中3種蛋白的表達進行了比較，結果顯示，無論哪種方案，D5與D6內膜3種蛋白的相對表達量差異均無統計學意義。這與其他學者的結果有所不同，可能原因有以下幾點：①D5、D6時間較接近。延長間隔時間并且多取幾個時間點，也許會發現明顯差異。②實驗條件稍有欠缺，未能聯合電鏡掃描觀察胞飲突。③樣本量較小。④不同方案可能會使種植窗范圍擴大，只觀察D5、D6可能不足以判斷出種植窗開放是提前還是推遲。

綜上所述，在促排卵過程中，應根據內膜情況、胚胎情況、激素水平及卵巢大小等充分評估子宮內膜容受性及患者安全性，當發現子宮內膜容受性下降，應采取全胚冷凍，之后再根據適應證選擇自然周期方案或HRT方案進行[12-15]FET，從而提高受孕幾率。

[1] REN J,SHA A,HAN D,et al.Does prolonged pituitary down-regulation with gonadotropin-releasing hormone agonist improve the live-birth rate in in vitro fertilization treatment?[J].Fertil Steril,2014,102(1):75

[2] MINAS V,LOUTRADIS D,MAKRIGIANNAKIS A.Factors controlling blastocyst implantation[J].Reprod Biomed Online,2005,10(2):205

[3] LLLERA M1,LORENZO PL,GUI YT,et al.A role for alphavbeta3 integrin during implantation in the rabbit model[J].Biol Reprod,2003,68(3):766

[4] SERAFINI PC,SILVA ID,SMITH GD,et al.Endometrial claudin-4 and leukemia inhibitory factor are associated with assisted reproduction outcome[J].Reprod Biol Endocrinol,2009,7:30

[5] 郭藝紅，孫瑩璞，喬玉環，等.不同用藥方案對小鼠種植窗期子宮內膜白血病抑制因子及胞飲突表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版)，2010,45(2)：202

[6] 黃荷鳳,石一復,周馥貞,等.醋酸亮丙瑞林輔助排卵對雌二醇和子宮內膜分泌功能的影響[J].中華婦產科雜志,1996,31(2):103

[7] HUANG HF,XIA YAXIAN,SHI YIFU,et al.Effect of ovarian stimulation with or without GnRH agonist on hamster endometrial secretion[J].J Zhejiang University(Science A),2000,1(3):342

[8] 楚喜英,宋玉霞,萬利靜,等.坤泰膠囊對控制性超排卵小鼠子宮內膜厚度及白血病移植因子表皮生長因子蛋白表達的影響[J].中華醫學雜志,2014,94(29):2300

[9] 李曉旭.中藥坤泰膠囊對小鼠種植窗期子宮內膜LIF、EGF和IGF-1表達的影響[D].鄭州:鄭州大學,2015.

[10]JOHNSON GA,BURGHARDT RC,BAZER FW,et al.Osteopontin: roles in implantation and placentation[J].Biol Reprod,2003,69(5):1458

[11]NAWROTH F,LUDWIG M.What is the ′ideal′ duration of progesterone supplementation before the transfer of cryopreserved-thawed embryos in estrogen/progesterone replacement protocols?[J].Hum Reprod,2005,20(5):1127

[12] 郝桂敏.全部胚胎冷凍的時代是否來臨[J].生殖與避孕，2016,36(9)：785

[13]CHEN ZJ,SHI Y,SUN Y,et al.Fresh versus frozen embryos for infertility in the polycystic ovary syndrome[J].N Engl J Med,2016,375(6):523

[14]LI Z,WANG YA,LEDGER W,et al.Clinical outcomes following cryopreservation of blastocysts by vitrification or slow freezing: a population-based cohort study[J].Hum Reprod,2014,29(12):2794

[15]高婷婷,賀曉,張亨德,等.PCOS不孕患者行新鮮與冷凍周期胚胎移植的妊娠結局比較[J].生殖醫學雜志,2016,25(11):973

(2016-12-25收稿 責任編輯王 曼)

Effects of different ovarian stimulation and hormone replacement therapy on expressions of LIF, IL-1β and integrin αVβ3 in human endometrium during the implantation window

TANLi,LIUXinyuan,CHUXiying,LUNa,XIANGYungai,SONGYuxia,LIPengfen

ReproductiveCenter,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

induced ovulation;controlled ovarian hyperstimulation;hormone replacement therapy;endometrial receptivity

Aim: To observe the outcome of different protocols，induced ovulation, controlled ovarian hyperstimulation(COH) and hormone replacement therapy(HRT), on human endometrial receptivity during the implantation window. Methods: A total of 60 patients were enrolled, among them, 10 cases underwent induced ovulation, 20 cases underwent COH, 10 cases received HRT, and 20 cases were natural ovulation cycle. Ovarian endometrium on the 5th or 6th day(D5 or D6) after ovulation of the half subjects were collected to detect LIF,IL-1β, and integrin αVβ3 by immunohistochemical SP method, respectively. Results: The expressions of these three proteins in endometrium were natural ovulation cycle group>HRT group>COH group>induced ovulation group (P<0.05). The expressions of these three proteins in endometrium on D5 and D6 had no statistical difference(P>0.05). Conclusion: HRT might have the minest injury on the endometrial receptivity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.022

*河南省教育廳科技攻關項目 142300410240

R715

△女，1964年4月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：輔助生殖技術與生殖內分泌，E-mail:litan668@126.com